Универсальный биочип

Ученые Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН могут теперь одновременно определять содержание нескольких маркеров онкологических заболеваний в сыворотке крови пациента.

Это стало возможным благодаря использованию белковых гидрогелевых биочипов. Точная и своевременная диагностика - одна из главных проблем в онкологии. По словам специалистов, из-за низких показателей выживаемости больных после появления клинических признаков заболевания в последнее время возрастает необходимость внедрения простых и неинвазивных методов для ранней диагностики раковых опухолей. Однако провести цитологические и гистологические исследования, а также иммунологическую идентификацию опухолевых клеток до операции часто бывает невозможно из-за труднодоступности опухолевого очага.

Опухолевые маркеры  

В настоящее время для диагностики первичной опухоли или ее метастазов, а также мониторинга лучевой и химиотерапии широко используется определение опухолевых маркеров в сыворотке крови пациента. Генетические нарушения, имеющиеся в опухолевых клетках, приводят к изменению синтеза белков, в том числе синтезу мутантных форм, нарушениям экспрессии - повышению или снижению синтеза того или иного белка, появлению белков, характерных для эмбрионального периода развития. Качественная и количественная оценка всех этих белковых молекул обычно проводится иммунохимическими методами, где данные белки выступают в роли антигенов. В классическом понимании онкомаркеры - это антигены, которые могут быть выявлены в опухолевой ткани и циркулируют в кровотоке онкологических больных.

Как мне рассказали в Институте молекулярной биологии РАН, диагностическая значимость опухолевого маркера зависит от его чувствительности и специфичности. И практически «идеальных маркеров», то есть маркеров с почти 100%-ной специфичностью и 100%-ной чувствительностью (обязательно выявляемых даже на ранних стадиях развития опухоли), пока нет. До сих пор не удалось разработать ни одного строго опухолеспецифичного теста, способного определять только злокачественную опухоль данного типа.

- Основным применением иммунохимических маркеров являются мониторинг заболевания и оценка эффективности хирургического лечения и (или) радио-химио- или гормонотерапии, - говорит научный сотрудник ИМБ РАН кандидат химических наук Елена Савватеева. - Причем наибольший интерес в этом случае представляет именно динамика уровня маркера, а не его единичное значение. Возрастание концентрации опухолевого маркера позволяет делать заключение о прогрессировании заболевания, в частности о метастазировании.

Чем больше, тем лучше

Несмотря на то что число потенциальных молекулярных маркеров растет, для большинства раковых заболеваний не существует простого теста для обнаружения опухоли на ранней стадии, пригодного для обследования населения. Это связано с низкой чувствительностью и специфичностью большинства опухолевых маркеров. В настоящее время существует целый ряд научных работ, посвященных исследованию диагностической значимости различных комбинаций онкомаркеров при раковых заболеваниях.

- Увеличить возможности дифференциальной диагностики заболеваний, повысить эффективность скринингового анализа сможет только одновременное определение нескольких онкомаркеров, - говорит руководитель группы белковых микрочипов ИМБ РАН кандидат химических наук Алла Рубина. - Традиционные иммунологические методы позволяют выявлять содержание лишь одного маркера в одном анализе клинического образца, поэтому в настоящее время большие надежды в области диагностики рака связывают с использованием мультиплексных систем, таких, например, как биологические микрочипы (биочипы).

Новый этап онкодиагностики

Как рассказывает Алла Рубина, биологический микрочип представляет собой массив микроэлементов, содержащих различные биологические молекулярные зонды. Биочип создавался как инструмент многопараметрического анализа образца. Принципиальным отличием биочипов, разработанных в Институте молекулярной биологии РАН, от других матричных биочипов является иммобилизация зондов не на плоской поверхности подложки, а в объеме элементов гидрогеля полусферической формы (ячеек). Изготовление гидрогелевых биочипов основано на методе полимеризационной иммобилизации молекулярных зондов в ходе формирования гелевых ячеек микрочипа. Такой подход позволяет создавать биочипы, содержащие молекулярные зонды различной природы (ДНК, РНК, белки, олигосахариды или даже клетки). На каждом биочипе можно одновременно проводить различные типы реакций.

Для белковых биочипов метод иммобилизации обеспечивает максимальные преимущества по сравнению с другими методами изготовления биологических микрочипов, в которых иммобилизация молекулярных зондов происходит непосредственно на поверхности подложки. Разнообразие физико-химических свойств белков делает их иммобилизацию в формате микрочипа достаточно сложной задачей, поскольку белковые молекулы особенно восприимчивы к их окружению и контактам с гидрофобной поверхностью. Технология изготовления гидрогелевых биочипов позволяет проводить иммобилизацию белков без потери исходной активности и биологических свойств, а гидрофильное, практически водное, окружение иммобилизованных в объеме гелевых ячеек белковых молекул обеспечивает длительный срок хранения белковых биочипов.

Появление гидрогелевых белковых биочипов позволило ученым ИМБ РАН осуществить перенос макроварианта иммунохимического анализа в формат биологического микрочипа. Появилась возможность проводить многопараметрический количественный анализ биологического образца и одновременно определять содержание нескольких антигенов, таких как маркеры онкологических заболеваний, биотоксины, аллергены...Тем самым один анализ на биочипе может заменить и уже заменяет несколько (в случае онкомаркеров - 9) индивидуальных иммунохимических анализов в макроварианте.

К примеру, с помощью созданного в Институте молекулярной биологии РАН набора реагентов можно проводить одновременное количественное определение общей и свободной форм простатспецифического антигена (ПСА) и их соотношения в сыворотке крови человека методом иммунофлюоресцентного анализа на биологическом микрочипе. Тест-система предназначена для диагностики рака предстательной железы (РПЖ) и рекомендована для проведения скрининга мужского населения старше 50 лет и групп риска.

РПЖ - одна из наиболее распространенных форм рака у мужчин. ПСА благодаря своей уникально высокой специфичности к данному виду опухоли получил широкое внедрение в клиническую практику для диагностики и мониторинга РПЖ. Измерение концентраций двух форм антигена, а также их соотношения в сыворотке крови больного позволяет медикам проводить дифференциальную диагностику злокачественных и доброкачественных заболеваний предстательной железы.

Определение свободного и общего ПСА имеет два основных применения в клинической практике: мониторинг эффективности терапии карциномы предстательной железы и мониторинг состояния пациентов с гипертрофией предстательной железы.

Метод одновременного количественного определения общей и свободной форм ПСА в сыворотках крови на биологическом микрочипе дает возможность проводить анализ в формате «один пациент - один биочип». Процедура основана на одностадийном сэндвич-иммуноанализе с флюоресцентной регистрацией сигнала. Биочип содержит гелевые элементы с иммобилизованными антителами, специфичными к каждой из форм ПСА, и ряды элементов с иммобилизованным антигеном в возрастающих концентрациях (внутреннюю калибровочную кривую), что позволяет проводить параллельный анализ двух форм ПСА без построения калибровочных кривых, необходимых для анализа с помощью традиционных ИФА-систем.

Сотрудниками группы Аллы Ру-биной была проведена экспериментальная эксплуатация разработанной тест-системы в трех профильных московских медицинских учреждениях: НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН, Центральной клинической больнице Управления делами Президента РФ и Российском научном центре хирургии им. Б.В.Петровского РАМН.   Тестирование   ученые проводили на клиническом материале, с использованием большого набора сывороток крови больных онкологическими заболеваниями и здоровых доноров. В результате такого исследования оказалось, что онкодиагностика, проводимая с помощью гидрогелевых биочипов, ничуть не уступает по эффективности стандартным и хорошо зарекомендовавшим себя зарубежным диагностическим системам. Теперь есть возможность количественно определять сразу 6 маркеров онкологических заболеваний: общей и свободной форм ПСА, альфафетопротеина (АФП), ракового эмбрионального антигена (РЭА), хорионического гона-дотропина (ХГТ), нейронспецифической енолазы (НСЕ) в сыворотке крови человека. В основе этой тест-системы лежит биочип, содержащий как иммобилизованные антитела против 6 анализируемых онкомаркеров, так и иммобилизованные антигены (онкомаркеры). В качестве метода анализа используется также и одностадийный сэндвич - иммуноана-лиз с флуоресцентной регистрацией сигнала. Данный набор реагентов также прошел медицинские испытания и рекомендован для применения в клинической практике на территории России. Сотрудники ИМБ разрабатывают и другие тест-системы. Например, одна из них рассчитана на одновременное количественное иммуноаналитическое определение серологических онкомаркеров, имеющих диагностическое значение для выявления ранних стадий опухолеобразования при раке яичников и раке молочной железы, к примеру, таких, как раковые антигены СА 125, СА 15-3 и др.

- Помимо одновременного количественного определения 6 показателей при проведении анализа на биочипе происходят еще выявление и контроль хук-эффекта, - говорит руководитель группы А.Рубина. - В иммунодиагностических системах, основанных на одностадийном сэндвич-анализе, при высоких концентрациях аналита в пробе возможно возникновение так называемого хук-эффекта, при котором зависимость величины регистрируемого сигнала от концентрации аналита становится обратно пропорциональной. В традиционных тест-системах проявление хук-эффекта можно выявлять и контролировать только в одном случае - используя многократные, последовательные разведения анализируемого образца. Новый метод позволяет выявлять хук-эффект непосредственно при проведении анализа, что дает возможность избежать искажения диагностической картины при высоких концентрациях определяемого вещества в пробе и значительно упрощает процедуру проведения анализа.

В контакте с клиницистами

- Технология биологических микрочипов позволяет практически неограниченно расширять панель исследуемых антигенов и, в конечном счете, создавать универсальную многопараметрическую тест-систему для одновременного количественного определения панели онкомаркеров. В настоящее время мы разрабатываем такую тест-систему для одновременного количественного определения 9 онкомаркеров, - подчеркивает Алла Рубина.

В рамках одного обследования пациента теперь можно будет проводить дифференциальную диагностику широкого круга онкологических заболеваний и раннее обнаружение злокачественных опухолей различной локализации. Кроме этого, одновременное определение содержания панели основных серологических онкомаркеров позволит также уточнить имеющиеся представления об их диагностической значимости и специфичности к различным видам опухолей, а также целесообразности использования тех или иных комбинаций онкомаркеров при первичном обследовании пациентов из групп риска.

С точки зрения классических методов иммуноанализа сбор статистического материала одновременно по всем известным маркерам для выявления таких комбинаций - очень сложный, трудоемкий и дорогой процесс. Использование современной диагностики на основе биочипа поможет гораздо быстрее получить необходимый набор данных. Многопараметрическая тест-система для определения 9 онкомаркеров сейчас проходит экспериментальную эксплуатацию в ряде медицинских учреждений. В тесном союзе с медиками осуществляется сбор статистического материала на верифицированных независимыми методами сыворотках крови больных как онкологическими, так и не онкологическими заболеваниями, а также на сыворотках крови здоровых доноров.

- Нам крайне важно находиться в постоянном контакте с клиницистами, - отмечает Алла Рубина, - ибо только в результате совместных усилий может быть создан действительно востребованный в клинике, новый тип диагностических систем, который облегчит жизнь всем: и врачам, и пациентам.

Если говорить о практической стороне современных методов диагностики, то стоимость одного анализа для пациента, проведенного с помощью нового типа тест-системы, будет на порядок меньше, чем при индивидуальном анализе той же панели онкомаркеров с помощью традиционных, используемых в клинике методов. Это будет способствовать тому, что здоровые люди или люди без клинических проявлений заболевания, когда оно еще находится на самой ранней стадии, смогут позволить себе превентивную комплексную диагностику. Своевременная оценка состояния здоровья пациента и выявление злокачественных изменений на ранних стадиях, в свою очередь, позволит врачу осуществлять правильный выбор эффективных средств лечения и приведет к снижению смертности людей от онкологических заболеваний.

Татьяна КУЗИВ, корр. «МГ».