Волосы как гарантия защиты

Мы живем в окружении патогенных микроорганизмов, однако наши эпителиальные ткани представляют собой первую линию не только клеточной, но и химической защиты от инфекционных агентов. Слезный секрет, слюна и пот содержат вещество лизоцим, способное убивать микроорганизмы. За последние 20 лет открыт целый класс новых антимикробных пептидов человека (АМП), имеющих такую же функцию. Зачастую их даже называют эндогенными антибиотиками.

Эндогенные антибиотики

-    Впервые эти соединения были обнаружены у насекомых, поскольку известно, что у них отсутствует адаптивный иммунитет в виде антител и лимфоцитов, - рассказывает сотрудник лаборатории моделирования процессов культивирования микроорганизмов НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН, доктор биологических наук Вера Арзуманян. - Позже выяснилось, что антимикробные пептиды предохраняют эпителиальные поверхности всех многоклеточных организмов. Сейчас известно более 500 различных АМП, обнаруженных во многих организмах от насекомых до человека. Большинство этих пептидов относятся к катионным белкам. Они отличаются по аминокислотной последовательности и вторичной структуре, но схожи тем, что могут нейтрализовать отрицательно заряженные фосфолипиды, которыми изобилуют наружные мембраны микроорганизмов. Достаточно нескольких микрограммов АМП, чтобы вызвать гибель болезнетворных микробов.

Спектр активности АМП очень широк - бактерии, грибы, вирусы... Также есть данные об их активности в отношении некоторых видов опухолевых клеток. Но АМП выполняют не только свою непосредственную антимикробную функцию - они еще являются медиаторами воспаления и участвуют в таких разнообразных процессах, как пролиферация, иммунная индукция, заживление ран, выброс цитокинов, окислительно-восстановительный гомеостаз, и многих других. На слизистых и сухих эпителиальных тканях человека одновременно действуют около двух десятков АМП, причем для каждого локуса имеются как общие, так и специфические АМП.

Начали... с грибка

В 2007 г. ученые Института вакцин и сывороток совместно с сотрудниками Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И.Кулакова (профессор Л.Комиссарова и аспирант Е.Мальбахова ) приступили к изучению причин возникновения и упорного течения вульвовагинального кандидоза - молочницы. Вульвовагинальным кандидозом (ВВК) страдают женщины репродуктивного возраста, при этом специалисты различают острый ВВК, которому подвержены до 75% женщин, и хронический   рецидивирующий   ВВК (до 20%).

Факторов, способствующих развитию ВВК, немало. Это и присутствие основных заболеваний (инфекционных, эндокринопатических, аутоиммунных), а также механические травмы, химические факторы (применение кортикостероидов, цитостатиков, антибиотиков, оральных контрацептивов); беременность. При системных кандидозах ведущая роль в защите организма принадлежит клеточному иммунитету, а именно - полиморфно-ядерным лейкоцитам. При кандидозах слизистых оболочек, исключая ВВК, наиболее важными являются ТМ-клетки, причем как циркулирующие в крови, так и локальные.

-    На момент начала наших исследований мы обнаружили лишь две публикации в доступной литературе об АМП, участвующих в защите слизистых оболочек влагалища, - говорит В.Арзуманян. - Например, в работе американского исследователя Эрики Валоре изучались пептиды лактоферрин, кальпротектин, лизоцим, секреторный ингибитор лейкопротеазы, кателицидины и дефензины. Валоре установила, что каждой женщине присущ собственный спектр этих соединений, отличающийся по количественному и качественному составу в пределах, указанных АМП. Целью нашего исследования явилось решение следующей задачи: какой именно из факторов местного иммунитета при ВВК обладает наибольшим непосредственным противогрибковым действием в отношении кандида? Другими словами, что же именно сдерживает размножение клеток этих грибов, и почему при молочнице они всё-таки усиленно размножаются? Ведь каким бы ни был индивидуальный набор АМП, результат их действия реализуется в виде совокупной противогрибковой активности вагинального секрета.

Ученые приняли решение обследовать женщин репродуктивного возраста с различными формами ВВК, условно разделенных на две основные группы по наличию или отсутствию хронического процесса. Каждая группа была разделена еще на две подгруппы в зависимости от фазы процесса на момент обследования. Группам присвоили названия: ХВВКО - хронический ВВК в стадии обострения, ХВВКР - хронический ВВК в стадии ремиссии, ОВВК - острый ВВК и АСИМ - отсутствие типичных признаков ВВК на момент обследования. Образцы вагинального отделяемого специалисты института собирали с помощью тампонов, затем смывали, фильтровали через бактериальный фильтр и сгущали до исходной концентрации. Эти образцы проверялись на противогрибковую активность в отношении тест-культуры Candida. Также оценивалась эффективность фагоцитоза в вагинальном отделяемом. Она определялась по соотношению между числом грибных клеток, поглощенных фагоцитами, и общим числом грибных клеток, находящихся в поле зрения микроскопа.

У всех этих женщин ученые оценивали тяжесть течения заболевания. Для такой оценки была использована совокупность типичных симптомов (зуд, жжение, характер и количество выделений), каждый из которых оценивали по трехбалльной шкале от 0 до 2. За 0 принимали отсутствие симптома, за 1 - умеренную выраженность, а за 2 - яркую выраженность симптома. Помимо этого, проводились стандартные посевы на грибковую микрофлору и оценивалось ее количество.

В результате проведенного исследования специалисты обнаружили, что сумма баллов, характеризующая тяжесть течения канди-доза, для группы ХВВКО варьировала в пределах от 5 до 13, тогда как для группы ХВВКР - от 1 до 9, для группы ОВВК - от 2 до 8, для группы АСИМ - от 1 до 6. Соотнесение всех вышеперечисленных показателей - фагоцитоза, антител, обсемененности грибами кандида и противогрибковой активности - с суммой баллов в изученных группах выявило тенденции развития ВВК.

Обобщая данные

- Мы заключили, что для категории пациенток, близкой к норме (АСИМ), наиболее значимым звеном местного иммунитета является активность растворимых противогрибковых компонентов вагинального секрета - АМП, - поясняет Вера Арзуманян. - Разделение белков показало, что концентрация пептидов у пациенток с асимптоматическим течением молочницы гораздо выше, чем при остром или хроническом течении заболевания. Понятно, что при высокой противогрибковой активности АМП в функционировании фагоцитов и иммуноглобулинов нет необходимости. Первичный острый процесс (ОВВК) обусловлен низкой противогрибковой активностью, но при этом характеризуется значительной активизацией фагоцитов и иммуноглобулинов. Мы отметили, что хронизация острого процесса (ХВВКО) также отличается низкой противогрибковой активностью и повышенным фагоцитозом, но менее частым обнаружением иммуноглобулинов, чем при ОВВК.

На основании данных микроскопии и культуральных тестов ученые сделали вывод: острая фаза хронического ВВК всегда сопровождается наибольшей выраженностью симптомов, обилием бластоспор, а зачастую и мицелиальных элементов, присутствием высевов. Эти данные согласуются с результатами исследований, проведенных на больших выборках пациенток с ВВК (2861 человек), где показано, что гифы мицелия - это маркер тяжести течения заболевания. В стадии ремиссии хронического процесса (ХВВКР) специалистами отмечались относительно высокая противогрибковая активность АМП, высокий уровень эффективности фагоцитоза и самый низкий уровень иммуноглобулинов.

- Непосредственная противогрибковая активность растворимой фракции вагинального секрета, по-видимому, является первым условием, сдерживающим размножение грибов, - говорит В.Арзуманян. - Причинами снижения этой активности могут являться, с одной стороны, уменьшение количества АМП, продуцируемых нейтрофилами и эпителиоцитами, с другой - изменение структуры АМП, приводящее к потере их активности. Организм вынужден восполнять дефицит АМП с помощью альтернативных механизмов - активизации местной фагоцитарной функции и увеличения синтеза специфических секреторных антител.

В продолжение своих исследований ученые провели аналогичную работу с группой женщин, больных бактериальным вагино-зом (БВ). В исследовании принимала участие докторант Т.Карапетян из Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И.Кулакова. В работе сопоставлялась антимикробная активность вагинального секрета с тяжестью течения бактериального вагиноза. Это заболевание характеризуется размножением атипичной микрофлоры - кокков и гарднерелл, а также снижением численности полезных микроорганизмов, таких как лакто- и бифидобактерии. БВ характеризуется также низкой кислотностью среды. Установлено, что именно снижение местной иммунной защиты локуса за счет уменьшения количества и активности АМП приводило к увеличению численности оппортунистической микрофлоры, снижению кислотности и истощению нормальной микрофлоры.

Иммунитет здоровых волос

Как рассказывает Вера Арзуманян, роль АМП в защите кожного покрова человека последние 10 лет интенсивно изучается. К настоящему времени известно, что в процессах принимают участие такие АМП, как дермцидины, кателицидины, дефензины, рибонуклеаза 7, псориазин и антилейкопротеаза. Доказана роль этих пептидов при некоторых заболеваниях кожи. Например, при псориазе уровни некоторых АМП выше, чем при атопическом дерматите, что, по-видимому, является причиной высокой обсеменен-ности стафилококками у атопических больных. Кроме того, наступление ремиссии у больных под действием солнечных лучей специалисты часто связывают с активацией синтеза АМП при ультрафиолетовом облучении.

- Несмотря на обилие информации, касающейся пептидов, связанных с кожей человека, до недавнего времени ничего не было известно о наличии химической защиты придатков кожи - волос и ногтей, - подчеркивает В.Арзуманян. - В то же время известно, что придатки кожи могут поражаться многими микроорганизмами, способными разлагать кератин. Очевидно, что роль альтернативных химических факторов, защищающих кожу (жирных кислот и ионов хлора), в защите придатков кожи минимальна. И нам оставалось предположить, что на первый план выходят эндогенные АМП, в связи с чем было проведено исследование наличия и активности пептидов в клетках здоровых волос. Работа проводилась совместно с научными сотрудниками НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН О.Сердюк, Н.Вартановой и И.Ожован.

Образцы волос ученые получали от женщин в возрасте от 7 до 50 лет, не пользующихся химической окраской и завивкой. Срезали свежевымытые волосы на расстоянии не менее 10 см от корней. Волосы измельчали ножницами, затем растирали в ступке с пестиком до полной гомогенности в специальном буферном растворе. Полученную бесклеточную массу специалисты осаждали и высушивали, после чего разводили до нужной концентрации. Тест-культурой явился штамм грибов Candida.

Три метода исследования

Для исследования антимикробной активности были использованы три метода - определение жизнеспособных клеток методом мик-роскопирования и посевов, а также определение зоны ингибиро-вания роста. Для микроскопиро-вания ученые соединяли тест-культуру с полученным экстрактом, инкубировали несколько часов в термостате, окрашивали и микроскопировали. Оказалось, что после обработки контрольным раствором практически все клетки остались живы, в то время как в опытном образце, обработанном экстрактом волос, живых клеток практически не обнаруживалось. Большая часть клеток была убита, причем наблюдались не просто деструкция мембран, характерная для действия АМП, но даже разрушение клеточных стенок.

Для определения антимикробной активности методом посевов, клетки грибов кандида соединяли с экстрактом волос, перемешивали и отсевали по капле смеси сразу и по прошествии определенного времени на чашки Петри с питательной средой. Через двое суток инкубации в термостате подсчитывалось число выросших колоний. Ученые установили, что в течение трех часов смесь теряла до 52% клеток. При этом клетки, обработанные контрольным раствором, полностью сохраняли жизнеспособность.

Определение зоны ингибирования роста сотрудники НИИ проводили следующим образом: в теплую расплавленную среду засевали тест-культуру и разливали в две чашки Петри. Затем по центру чашек наносили по капле экстракта волос (опытная чашка) и контрольного раствора (контрольная чашка). Чашки инкубировали и оценивали рост клеток тест-культуры. Использование этого метода говорило о существовании зоны просветления диаметром 15 мм в опытном варианте при отсутствии таковой в контрольном варианте.

Тремя различными способами ученые института доказали наличие антимикробной активности экстрактов волос. Более глубокий анализ позволил установить наличие пептидов, схожих с АМП, выделяемых кожей. Таким образом, экстракты здоровых волос обладают противомикробным действием, вызывающим лизис клеточных мембран микроорганизмов. Противомикробное действие экстрактов волос обусловлено наличием внутриклеточных антимикробных пептидов. Кератиноциты волос, как и кератиноциты кожи, содержат эндогенные пептиды, которые играют важную роль во врожденной защите волос от кератинофильных микроорганизмов.

Задачка для иммунологов

- Уже очевидно, что само существование АМП является гарантом защиты человека от болезнетворных микроорганизмов, однако дефицит этих соединений приводит к нежелательным последствиям, - подчеркивает Вера Арзуманян. - Поскольку все АМП продуцируются клетками иммунной защиты, снижение уровней пептидов должно быть обусловлено либо уменьшением функции синтеза этих соединений в клетках, либо снижением количества самих клеток, либо изменением структуры АМП, приводящим к потере активности. В любом случае первичным по отношению к АМП, по-видимому, является локальный клеточный иммунитет. Как стимулировать клетки иммунной системы на выработку активных молекул АМП - это задача для иммунологов и микробиологов. Пока могу сказать лишь одно: на основе знаний, полученных о структуре и функции пептидов, разрабатываются новые противомикробные препараты. Многие синтетические и рекомбинантные аналоги АМП находятся в стадии фармацевтических исследований. Можно ожидать, что аналоги природных пептидов будут обладать не только антимикробным действием, но и выступать в качестве иммуномодуляторов.

Татьяна КУЗИВ, корр. «МГ».