В клиниках и лабораториях. Релиз­активность. Современный взгляд на гомеопатию и негомеопатию.

В предлагаемом читателю эссе приведены данные, которые позволяют с позиции современных знаний взглянуть на проблему «малых доз», продемонстрировать перспективы их использования, а также приподнять занавес таинственности, покрывающий гомеопатию.

Более 20 лет я и мои коллеги – научные сотрудники научно­производственной фирмы «Материа Медика» совместно с ведущими научно­исследовательскими центрами нашей страны посвятили комплексному углублённому, не имеющему аналогов изучению возможностей процесса многократного разведения исходного вещества, впервые применённого основоположником гомеопатии С.Ганеманом и названного им потенцированием. Проведено около 350 экспериментальных исследований с участием лабораторий из 17 стран, несколько десятков клинических исследований, в том числе международных. Полученные результаты позволили прийти к выводу, что технология потенцирования открывает перед современной наукой и техникой новые возможности.

Мы впервые установили, что внешне простая процедура последовательного многократного уменьшения концентрации веществ является сложной технологией, продукты которой приобретают уникальные позитивные свойства. Исторически продукты технологии потенцирования называют «малыми дозами», «гомеопатическими дозами», «потенцированными препаратами», «высокими разведениями». Как мы покажем ниже, эти термины не совсем корректны, но мы будем пользоваться ими как устоявшимися словосочетаниями. Для потенцированных препаратов вместо дозировки указываются шкала разведения (С – сотенная, D – десятичная) и степень разведения; в разведениях выше С12 или D24 в соответствии с числом Авогадро молекулы исходного вещества уже не должны содержаться.

В 1995–1998 гг. мы провели серию экспериментальных и клинических исследований, по окончании которых смогли сформировать современный научный подход к проблеме «малых доз». Для исследований был предложен парадоксальный алгоритм, приведший к парадоксальному результату. Животным одновременно вводили «обычную» – терапевтическую или токсическую дозу известного фармакологического препарата и «малую дозу» этого же препарата (см. таблицу).

 

Примеры модификации фармакологических эффектов «малыми дозами» препаратов

 

Метод исследования	Оцениваемый параметр	Эффект при введении с «малыми дозами» препаратов
Диклофенак
Тест отдёргивания хвоста	Латентное время болевой реакции	Увеличение латентного времени болевой реакции
Модель «уксусные корчи»	Количество корчей	Сокращение числа корчей
Тест Гаффнера	Выраженность болевой реакции	Уменьшение выраженности болевой реакции
Тест «Открытое поле»	Пробег, стойки, норки, выходы в центр, умывания, дефекации, уринации	Снижение выраженности побочных эффектов диклофенака
Интактные животные + токсическая доза диклофенака	Смертность, динамика массы тела, изменения в поведении	Укорочение времени реабилитации и уменьшение снижения массы тела
Галоперидол
Интактные животные + галоперидол	Скорость локомоции, мембранный потенциал командных нейронов оборонительного поведения	Снижение скорости локомоции и гиперполяризация командных нейронов оборонительного поведения
Пароксетин
Модели конфликтной ситуации по Vogel	Число наказуемых взятий воды	Увеличение числа наказуемых взятий воды как при курсовом, так и при однократном введении
Приподнятый крестообразный лабиринт	Время нахождения в светлом отсеке, общее число переходов	Увеличение времени нахождения в светлом отсеке и общего числа переходов как при курсовом, так и при однократном введении
Феназепам
Тест «Открытое поле»	Пробег, стойки, норки, выходы в центр, умывания, дефекации, уринации	Увеличение двигательной активности крыс
Тест «Вращающийся стержень»	Число упавших со стержня животных	Уменьшение числа упавших со стержня животных
Судороги, вызванные коразолом	Латентный период наступления судорог, доля животных с тоническими судорогами и смертельным исходом	Увеличение латентного периода наступления судорог, уменьшение количества животных с тоническими судорогами и смертельным исходом
Морфин
Абстинентный синдром отмены морфина	Скорость реакции самостимуляции	Увеличение функциональной активности и положительной эмоциональной поддержки
Морфинная наркотизация	Порог ноцицептивной реакции	Активация антиноцицептивной реакции
Интактные животные + токсическая доза морфина	Определение летальных доз	Изменение летальных доз морфина
Интактные животные + морфин	Потребление кислорода	Снижение повышенного морфином потребления кислорода
Абстинентный синдром отмены морфина	Поведение в тесте вынужденного плавания и реакция избегания освещённых мест	Нормализующий эффект в рамках первого теста и уменьшение предпочтения темноты
Морфинная наркотизация	Реакция самостимуляции латерального гипоталамуса; поведенческие реакции, характеризующие выраженность абстинентного синдрома	Повышение частоты самостимуляции латерального гипоталамуса, ослабление реакции активного избегания, усиление реакции замирания на звуковой раздражитель, уменьшение времени развития реакции отдёргивания хвоста
Морфинная наркотизация	Поведение при применении световых стимулов	Уменьшение латентного периода реакции на световые стимулы
Изолированные нейроны высших позвоночных	Электрические параметры изолированных нейронов	Изменение электрических параметров изолированных нейронов
Этанол
Алкоголизация	Концентрация этанола, активность алкогольдегидрогеназы, определение содержания биогенных моноаминов	Предупреждение активации этанолом симпатико­адреналовой системы и замедление элиминации этанола из крови
Преднизолон
Модель «уксусные корчи»	Количество корчей и время их наступления, количество экссудата	Уменьшение количества корчей
Модель артрита, вызванного адъювантом Фрейнда	Масса отёка, оценка гемограммы	Уменьшение прироста отёка

 

Было установлено, что «малая доза» модифицирует воздействие фармакологического препарата на организм, что обычно проявлялось усилением основного терапевтического действия препарата и одновременно уменьшением его токсичности (в 1997–1998 гг. мы успешно провели клинические исследования препаратов на основе «малых доз» для дезинтоксикации, но отказались от разработки этого направления, а также от разработки препаратов, содержащих «большую» и «малую» дозы одновременно, ради создания препаратов на основе высоких разведений антител). В единичных случаях повышение активности сопровождалось незначительным усилением токсичности. На рисунках 1­5 приведены наиболее яркие примеры модифицирующего действия «малых доз».

Полученные результаты позволили сделать несколько важных выводов:

1. По своим свойствам «малые дозы» не идентичны исходному веществу, а следовательно, являются отдельным, «самостным» материальным объектом и, возможно, со временем физики смогут определить их природу. Поскольку эффекты «высоких разведений» не могут быть обусловлены молекулами исходного вещества, мы предположили, что носителем свойств «малых доз» является обособленный (дискретный) супрамолекулярный материальный фактор. Об этом косвенно свидетельствует выявленная нами зависимость эффекта «потенцированных препаратов» от «дозы» (степени разведения, условий приготовления, объёма разведений или количества таблеток, частоты назначения) (рис. 6, 7 и 18А).

Более того, в «высоких разведениях» содержится ограниченное количество предполагаемого супрамолекулярного фактора. На примере диклофенака с использованием иммуноферментного анализа (ИФА) (рис. 8) мы показали, что «малая доза» диклофенака способна изменять взаимодействие со своими антителами не всех молекул диклофенака в иммуноферментной реакции, а только их определённой части.

2. Общим уникальным свойством «малых доз» является способность воздействовать на исходное вещество, модифицируя его биологические и физико­химические характеристики (образно говоря, «малая доза» превращается в катализатор (модификатор) действия исходного вещества). Данное свойство носит крайне важный для использования в фармакологии сугубо специфический (специфичность проявляется в том, что действие любого «высокого разведения» направлено только на исходное вещество или его биологические мишени в организме, структурно схожие с исходным веществом)  характер; является техногенным и не зависит от наличия молекул в препарате. Приготовленные в процессе потенцирования «высокие разведения», как содержащие детектируемые количества молекул исходного вещества, так и не содержащие их, обладают модифицирующим действием, что подчёркивает роль потенцирования в происхождении «модифицирующего» феномена.

Понятие «доза» подразумевает часть вещества, имеющую те же свойства, что и исходное вещество. «Малые дозы» обладают отличными от исходного вещества особыми свойствами, и, по сути, дозами не являются. Чтобы подчеркнуть техногенное происхождение активности «высоких разведений», мы предлагаем использовать термин «релиз­активные препараты» (Р­А­препараты), то есть препараты с активностью, высвободившейся в результате процесса приготовления «высоких разведений» исходного вещества.

3. Специфический характер модифицирующих свойств однозначно свидетельствует о том, что в присутствии основного препарата его Р­А­форма воздействует на те же мишени, сенситизирует их и подготавливает к взаимодействию с основным препаратом. Например, Р­А­диклофенак значимо усиливает ингибирующее воздействие диклофенака в «обычных» дозах на его мишень – циклооксигеназу (рис. 9).

Поскольку с 1998 г. мы преимущественно изучаем Р­А­антитела, на их примере мы установили основные молекулярные механизмы «высоких разведений». Далее мы покажем, что «высокие разведения» способны вызывать тонкие конформационные изменения в молекулах­мишенях, что сопровождается изменением характера взаимодействия лигандов с мишенями и включает цепочку молекулярных событий, обусловливающих действие «малых доз».

Открытие основного – модифицирующего действия Р­А­разведений позволило с позиции современных знаний:

 оценить исторический опыт применения «малых доз» (экспериментальное изучение биологических эффектов; использование в гомеопатии);

 предложить новое – современное таргетное (направленное на биологические мишени) использование продуктов технологии потенцирования.

 

Исторический опыт применения «малых доз»

Начиная с 1920­х годов фармакологи и биологи выявили большое количество биологических эффектов «малых доз» (рис. 10). В России наибольшую популярность получили работы одного из основоположников советской фармакологии академика Н.Кравкова, выдающегося физиолога академика И.Ашмарина и прежде всего профессора Е.Бурлаковой, которой была установлена полимодальная зависимость эффектов потенцированных препаратов от степени разведения и показано, что «малые дозы» воспроизводят лишь часть биологического спектра «обычных» доз.

Действие «малых доз» оказалось плохо воспроизводимым. В своё время скандальную известность получила история с публикацией в журнале «Nature» результатов эксперимента Ж.Бенвениста, которому удалось «высокими разведениями» антител к IgE вызвать дегрануляцию базофилов, но при проверке эффект не был воспроизведён, в итоге журнал «Nature» опубликовал опровержение.

Рис. 1. Оценка способности «малой дозы» диклофенака влиять на противовоспалительную активность диклофенака.

Исследование проводили на модели каррагенин­индуцированного воспаления у крыс Вистар. Животные за 60 минут до индукции отёка каррагенином получали внутрижелудочно раствор диклофенака (5 и 20 мг/кг) или его комбинацию (5 мг/кг) с «малой дозой» диклофенака или контролем. Противовоспалительный эффект исследуемых препаратов оценивали через 2 часа после индукции отёка в процентном отношении, исходя из данных массы лап до и после введения каррагенина. *p<0,05 по сравнению с крысами, получавшими диклофенак (5 мг/кг) + контроль.

 

Рис. 2. Оценка способности «малой дозы» диклофенака снижать токсичность диклофенака.

Исследование проводили на модели острой токсичности диклофенака на белых половозрелых крысах. Животные получали однократно внутрижелудочно (в/ж; 500­1000 мг/кг) или внутривенно (в/в; 70­130 мг/кг) диклофенака, растворённого или в дистиллированной воде, или в водном растворе «малой дозы» диклофенака. Способность «малой дозы» диклофенака снижать токсичность диклофенака оценивали через 14 суток после введения препаратов, рассчитывая показатель ЛД₅₀ (средняя смертельная доза).

 

Рис. 3. Оценка способности «малой дозы» феназепама влиять на анксиолитическую активность феназепама.

Исследование проводили на модели конфликтной ситуации по Vogel на беспородных крысах. Животные за 20 минут до начала измерений получали дистиллированную воду (контроль), феназепам (1 мг/кг) или комбинацию феназепама (1 мг/кг) и «малой дозы» феназепама. Анксиолитическую активность оценивали по числу наказуемых взятий воды. *p<0,05; **p<0,01 по сравнению с контролем.

 

Рис. 4. Оценка способности «малой дозы» галоперидола влиять на тяжесть каталепсии, вызванной введением галоперидола.

Исследование проводили на модели каталепсии на беспородных крысах. Для моделирования состояния каталепсии внутрибрюшинно (за 60 минут до начала наблюдения) вводили раствор галоперидола в дозе 0,07 мг/кг. «Малые дозы» галоперидола вводили одновременно с галоперидолом. Тяжесть каталепсии оценивали по 6­балльной шкале по способности животного сохранять искусственно приданную позу на протяжении времени. *p<0,05 по сравнению с крысами, получавшими 0,07 мг/кг галоперидола.

 

Рис. 5. Оценка способности «малой дозы» циклофосфана влиять на противоопухолевую активность циклофосфана.

Исследование проводили на модели карциномы лёгких Льюис на мышах с перевиваемыми опухолями. Циклофосфан вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 125 мг/кг через 10­13 суток после трансплантации опухолевых клеток. В опытных группах животные получали «малые дозы» циклофосфана внутрибрюшинно спустя 1 час после инъекции циклофосфана и в течение 8­10 суток. В контрольных группах животные получали растворитель в соответствующем режиме. Эффективность влияния на частоту метастазирования опухоли (в процентах от общего числа животных в группе) оценивали на 19­23­е сутки. *p<0,05 по сравнению с контролем;  ^#p<0,05 по сравнению с мышами, получавшими 125 мг/кг циклофосфана.

 

Рис. 6. Дозозависимость противовирусного эффекта «малых доз» антител к интерферону­.

Исследование проводили на модели летальной гриппозной инфекции на мышах линии BALB/c, заражённых 10 LD₅₀ вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1). Мыши получали «малую дозу» антител к интерферону­γ (ИФН­γ) или контроль внутрижелудочно в разных объёмах в течение 5 суток до и 21 суток после инфицирования, а также в свободном доступе с питьём. Животные контрольной группы получали осельтамивир (20 мг/кг в сутки) за 24 часа и 1 час до инфицирования и в течение 5 суток после инфицирования. Гибель животных оценивали дважды в день в течение 3 недель после инфицирования. *p<0,05 по сравнению с контролем.

 

Рис. 7. Дозозависимость анксиолитического эффекта «малых доз» антител к белку S100.

Исследование проводили на модели конфликтной ситуации по Vogel на крысах линии Rj: Вистар (Han). Животные в течение 4 суток получали внутрижелудочно «малые дозы» антител к белку S100, контроль, диазепам (2 мг/кг) или подкожно клобазам (64 мг/кг). Последнее введение – на 5­е сутки за 1 час до тестирования. Анксиолитическое действие препаратов оценивали по количеству наказуемых взятий воды из поилок. *p<0,05 по сравнению с контролем.

 

Рис. 8. Оценка способности «малых доз» диклофенака влиять на эффективность взаимодействия диклофенака с антителами.

Исследование проводили методом ИФА с использованием кроличьих поликлональных антител к диклофенаку. Перед проведением ИФА кроличьи поликлональные антитела к диклофенаку предварительно инкубировали с «малой дозой» диклофенака или контролем в соотношении 1 : 2 (v/v) в течение 1 часа. Затем проводили конкурентный ИФА: 100 мкл каждого из преинкубированных растворов антител с образцами и 100 мкл раствора диклофенака в различных концентрациях добавляли в лунки планшета, покрытые конъюгатом диклофенак­овальбумин (0,1 мг/мл), после чего следовали стандартному протоколу проведения ИФА. По изменению оптической плотности оценивали влияние «малых доз» диклофенака на количество образовавшихся комплексов «антитела к диклофенаку­диклофенак». *p<0,01 по сравнению с контролем.

 

Рис. 9. Оценка способности Р­А­диклофенака влиять на ингибирующую активность диклофенака в отношении циклооксигеназы­1.

Исследование проводили колориметрическим методом. Циклооксигеназу–1 (ЦОГ–1) преинкубировали с Р­А­диклофенаком, или с контролем в течение 1 часа при комнатной температуре с последующей инкубацией с диклофенаком (IC₅₀) в течение ещё 5 минут. Затем добавляли колориметрический субстрат и арахидоновую кислоту, измеряли оптическую плотность при 590 нм. *p<0,05 по сравнению с группой «ЦОГ–1 + контроль + диклофенак (IC₅₀)».

Полученные нами результаты, понимание того, что потенцированные препараты, вероятно, содержат супрамолекулярные детерминанты – носители активности, с учётом современных знаний об индивидуальных реакциях позволяют также рассмотреть в новом ракурсе проблему гомеопатии. На сегодняшний день известны как клинические варианты индивидуальных реакций (крапивница, отёк Квинке, анафилактический шок), так и экспериментальные модели реакций гиперчувствительности замедленного, немедленного типа и др. Эти реакции обладают одной общей особенностью – являются неспецифическими (единообразными). Например, отёк Квинке может вызвать любое из известных лекарственных средств, сотни аллергенов вызывают ограниченное число аллергических реакций.

 

Анализ опыта гомеопатии (главные выводы)

Предложивший гомеопатию С.Ганеман, по сути, является основоположником клинических испытаний лекарственных средств. Он впервые за всю историю медицины целенаправленно проводил исследование лекарственных препаратов в «высоких разведениях» на здоровых добровольцах и обнаружил, что в некоторых случаях они вызывают индивидуальные реакции, воспроизводящие в редуцированном виде картину интоксикации этим же препаратом в «большой» дозе.

Таким образом, в отличие от типовых индивидуальных реакций на лекарственные препараты в «обычных» дозах, имеющих цель заблокировать взаимодействие организма с молекулой­антигеном, на менее опасный для организма супрамолекулярный фактор – носитель релиз­активности – организм отвечает специфически.

На основании проведённых клинических исследований С.Ганеман предложил два терапевтических приёма, составляющих основу гомеопатии:

1. Симптомы, выявленные при испытании препарата на здоровых, использовать как симптомы­мишени при лечении больных (принцип подобия, от греческого óμοιος  – «подобный»).

2. Назначать гомеопатические препараты только больным с высокой индивидуальной чувствительностью к ним – в соответствии с фенотипическими маркёрами, которые С.Ганеман выявлял у «респондентов» на тот или иной гомеопатический препарат в ходе клинической апробации на здоровых добровольцах. Таким образом, цель гомеопатического назначения – вызвать «малой дозой» индивидуальную реакцию у пациента.

Исследования биологической активности «малых доз», проведённые нашими предшественниками – биологами, и наши собственные исследования показывают, что «высокие разведения» всегда вызывают молекулярно­клеточные реакции.

Мы впервые выявили, что при направленном (таргетном) применении выраженность физиологического действия Р­А­препаратов достаточна для оказания терапевтического действия и создания на основе «малых доз» лекарственных препаратов.

В дофармакологическую эру С.Ганеман, не зная о биологических особенностях «высоких разведений», предложил, по сути, единственную для своего времени возможность применения «малых доз», усиливая физиологическое действие «малых доз» через иммунологические механизмы индивидуальной чувствительности и вызывая индивидуальные реакции.

В связи с этим С.Ганеману и его последователям удавалось достичь терапевтического действия только в тех случаях, когда у больных с высокой индивидуальной чувствительностью нормальная физиологическая реакция на гомеопатический препарат на молекулярном уровне трансформируется в атипичный системный, целостный (холистический) ответ на уровне всего организма, вызывая позитивную перестройку его регуляции. В гомеопатии действует принцип «всё или ничего», встречающийся в иммунологии. Поэтому терапевтическая эффективность действия гомеопатических препаратов никогда не сможет быть доказана в рамках современных стандартных клинических исследований на однородной популяции больных; гомеопатия априори не может быть частью доказательной медицины. Любое «высокое разведение» обладает «потенциальной энергией», которую врач­гомеопат должен суметь целенаправленно филигранно использовать. Эффективность гомеопатической терапии полностью зависит от профессионализма врача­гомеопата, которому необходимо овладеть колоссальным объёмом знаний в виде описания действия нескольких тысяч гомеопатических препаратов. Даже опытным гомеопатам далеко не всегда на первом приёме удаётся определить «подходящий» данному больному препарат, что значимо ограничивает возможности этого метода.

С учётом того, что биология и её часть, медицина, принадлежат к естественным наукам, объектами их изучения являются закономерности живой Природы, то есть повторяющиеся, воспроизводимые события, поддающиеся статистической обработке. Поскольку индивидуальная реакция не может быть воспроизведена на всей популяции, в данном аспекте гомеопатия является врачебным искусством, донаучным эмпирическим методом лечения. В отличие от доказанных эффектов фармакологических препаратов любой гомеопатический препарат можно рассматривать как шанс на выздоровление – при условии, что врач­гомеопат сумеет вызвать у пациента позитивный индивидуальный ответ на назначенный препарат. Гомеопатическую терапию не следует противопоставлять современной медицине; гомеопатия может прекрасно дополнять общепринятую фармакотерапию, особенно при лечении хронических заболеваний.

 

Современное применение препаратов на основе «малых доз»

Гомеопатия – явный терапевтический прорыв для своего времени, но, конечно, она не может решать задачи гарантированного лечения, которые общество сегодня ставит перед медициной. Однако современные знания о тонких механизмах биологической регуляции организма позволяют использовать технологию потенцирования для создания эффективных инновационных препаратов.

В ходе нашей исследовательской работы мы обнаружили ранее неизвестное специфическое модифицирующее действие «малых доз», что открывает возможности для их направленного (таргетного) – фармакологического применения; доказали, что на основе «малых доз» регуляторных молекул могут быть созданы эффективные и безопасные биологические препараты.

Фармакологическое и гомеопатическое применение «малых доз» базируется на принципиально разных биологических механизмах. В первом случае выявляют и используют физиологическое действие «высоких разведений», во втором – их атипичные гиперергические индивидуальные реакции.

Вследствие этого фармакологические препараты в «малых дозах» должны соответствовать общим требованиям, предъявляемым к современным лекарственным средствам, и прежде всего проходить клинические испытания в соответствии с правилами доказательной медицины. Гомеопатические препараты, напротив, должны подвергаться гомеопатическому прувингу – исследованию на здоровых добровольцах с целью выявления клинических симптомов индивидуальных реакций.

Для того чтобы различать фармакологическое и индивидуальное применение препаратов, произведённых методом потенцирования, мы предлагаем для первых использовать термин «релиз­активные» препараты, а для вторых – «гомео­патические».

Нами заложены базовые основы фармакологии Р­А­препаратов на примере антител. Антитела были выбраны в качестве перспективных фармакологических агентов после того, как в 1998 г. под руководством академика М.Штарка на известной нейробиологической модели длительной посттетанической потенциации неожиданно было установлено, что «малые дозы» антител не подавляют активность молекул­антигенов, а модифицируют её, то есть оказывают сонаправленное с антигеном действие  (рис. 11).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

   

 

 

 

Рис. 11. Модифицирующая активность «малых доз» антител к белку S100.

 

Исследование проводили на поперечных срезах гиппокампа половозрелых крыс. Срезы помещали в камеру с проточной средой Ямамото, аэрируемой карбогеном, и инкубировали в течение 40 минут, затем регистрировали возбуждающие постсинаптические потенциалы (ВПСП). Для этого стимулирующий электрод помещали в область мшистых волокон, а регистрирующий стеклянный электрод – в область САЗ в зоне начальных сегментов апикальных дендритов. После выработки длительной посттетанической потенциации (ДПТП) к срезам добавляли тестируемые образцы и в течение 20 минут регистрировали ВПСП.

Данное обстоятельство существенно расширяет терапевтический потенциал антител, которые в современной фармакологии используются преимущественно в онкологии с целью подавления активности тех или иных молекул, участвующих в канцерогенезе. В «высоких разведениях» антитела могут применяться при лечении широкого круга соматических заболеваний.

Антитело представляет собой иммуноглобулин со сложной биохимической структурой, синтезируемый плазмоцитами – потомками β­лимфоцитов, который присутствует в сыворотке крови и других биологических жидкостях и предназначен для связывания молекул­антигенов. Связывание обеспечивается особенным строением антител (рис. 12).

 

Рис. 12. Строение иммуноглобулина G.

Иммуноглобулины содержат 2 вида парных полипептидных цепей: лёгкие (L, от англ. light – лёгкий), с низкой молекулярной массой, и тяжёлые (H, от англ. heavy – тяжёлый), с высокой молекулярной массой. Все 4 цепи соединены вместе дисульфидными связями. Каждая цепь представлена двумя внеклеточными иммуноглобулиноподобными доменами (вариабельным на NH­конце и константным), стабилизированными при помощи S­S­связей, и цитоплазматическим стабильным COOH­концом. N­концевые области L– и Н­цепей (V­область) образуют 2 антигенсвязывающих центра – (Fab)2­фрагмент. Fc­фрагмент молекулы взаимодействует со своим рецептором на мембране различных типов клеток (макрофаги, нейтрофилы, тучные клетки).

 

Вследствие уникальной структуры антител присущее всем «малым дозам» свойство целенаправленно воздействовать на исходное вещество (или его мишени в организме, структурно схожие с исходным веществом) заметно усилилось, когда мы начали использовать «малые дозы» антител.

Наиболее изученным в ходе экспериментальных исследований препаратом в «малых дозах» на данный момент является Анаферон, содержащий Р­А­антитела к интерферону­γ (ИФН­γ). На его примере с использованием спектроскопии ядерно­магнитного резонанса (ЯМР) установлены фундаментальные механизмы действия «малых доз» – способность изменять конформационные характеристики мишеней (в данном случае ИФН­γ), что приводит к «включению» физиологического ответа на введение в организм «малой дозы».

Как видно на рисунке 13, препарат изменяет конформационное состояние молекулы ИФН­γ. Как мы продемонстрировали, эти изменения конформации молекулы­мишени (ИФН­γ) лежат в основе всех последующих молекулярно­клеточных событий: в увеличении количества молекул ИФН­γ, связавшихся с рецептором (рис. 14), и, как следствие, в повышении экспрессии эндогенного ИФН­γ  (рис. 15), то есть приводят к активации сигнального пути ИФН­γ.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 13. Влияние Р­А­антител к ИФН­γ  на конформационное состояние молекулы ИФН.

Исследование проводили методом спектроскопии ЯМР. Р­А­антитела к ИФН­γ  или плацебо добавляли к ¹⁵N­меченному ИФН­γ. Спектры были получены с помощью стандартной последовательности импульсов HSQC в 2048 сканах в протонном измерении и 34 сканах в азотном измерении с задержкой в секунду. Наблюдаемые основные резонансы устанавливались на основании ранее опубликованных данных ЯМР, полученных при аналогичных условиях для ИФН­γ. Наверху: ¹⁵N­¹H­HSQC­спектры ИФН­γ в отсутствие (синий цвет) и в присутствии (красный цвет) Р­А­антител к ИФН­γ  (A) или плацебо (B). По осям абсцисс – ¹H­химический сдвиг (ppm), по осям ординат – ¹⁵N­химический сдвиг (ppm). Полноразмерные спектры (с 6,5 до 9,5 ppm) показаны на (I). Спектры двух участков, содержащих сильно пертурбированные сигналы, увеличены и показаны на (II) и (III).

Справа: картирование изменений химического сдвига, наблюдаемых в ¹⁵N­¹H­HSQC­спектре ¹⁵N­меченного ИФН­γ  после добавления Р­А­антител к ИФН­γ.

 

 

Рис. 14. Влияние Р­А­антител к ИФН­γ  на связывание молекулы ИФН­γ со своим рецептором.

Слева: исследование проводили с использованием моноцитов U­937 методом радиолигандного анализа. Для оценки общего связывания к клеткам добавляли тестируемые образцы, радиолиганд [¹²⁵I]­ИФН­γ; инкубировали 150 минут; центрифугировали; отбирали супернатант, отмывая от взвеси клеток, и регистрировали радиоактивность в течение 1 минуты с помощью счётчика  ­излучения. Показатели специфического связывания радиолиганда с рецептором ИФН­γ  рассчитывали как разность между общим и неспецифическим связыванием (измеренным в присутствии избытка немеченного ИФН­γ). * p<0,05 по сравнению с контролем ^#p<0,05 по сравнению с группой «Р­А­антитела к фактору некроза опухоли α (ФНО α)». Справа: схематичное изображение сигнального пути ИФН­γ.

 

Рис. 15. Влияние Р­А­антител к ИФН­γ  на продукцию клетками ИФН­γ.

Исследование проводили на мышах линии CBA/CaLac. Тестируемые образцы вводили перорально в течение 10 суток. На 4­е сутки после введения выделяли лимфоциты из взвеси селезёночных клеток мышей. Количество жизнеспособных лимфоцитов доводили до концентрации 2 х 10⁶ клеток/мл и инкубировали в полной культуральной среде в течение суток. Концентрацию ИФН­γ  в культуральных средах определяли с использованием ИФА. *p<0,05 по сравнению с контролем.

 

 На основе «малых доз» можно создавать не только средства, предназначенные для лечения соматических заболеваний, но и препараты с психотропной активностью. После того, как в 1998 г. мы открыли необычные модифицирующие свойства «высоких разведений» антител с использованием антисыворотки к белку S­100, антитела к этому белку в «малых дозах» были подвергнуты углублённому экспериментальному изучению, а на его основе был создан препарат Тенотен. В основе механизмов Тенотена лежит модификация физиологического действия нейроспецифического белка S­100.

На рисунках 16­-18 в качестве примера приведены результаты исследования анксиолитической, антидепрессивной и нейропротективной активности Тенотена, а также механизмы его действия.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 16. Результаты исследования анксиолитической и антидепрессивной активности Р­А­антител к белку S100.

Исследование проводили на модели конфликтной ситуации по Vogel (А) и модели вынужденного плавания по Nomura (Б) на беспородных белых крысах. Животные за 20 минут до тестирования получали внутрижелудочно контроль; Р­А­антитела к белку S100; внутрибрюшинно кетансерин (избирательный антагонист 5­НТ₂/5­НТ_1С рецепторов, 1 мг/кг) и через 10 минут Р­А­антитела к белку S100; препарат сравнения диазепам (2 мг/кг) или амитриптилин (15 мг/кг). Анксиолитический и антидепрессивный эффект исследуемых препаратов оценивали по количеству наказуемых взятий воды (А) и по количеству оборотов колёс (Б), которые животные делают в попытке выбраться из сосуда, заполненного водой, соответственно. *p<0,05 по сравнению с контролем, ^#p<0,05 по сравнению с группой, получавшей Р­А­антитела к белку S100.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 17. Результаты исследования нейропротективной активности Р­А­антител к белку S100.

Исследование проводили на модели ишемии головного мозга крыс Вистар. Перед введением тестируемых препаратов животным моделировали двусторонний фокальный ишемический очаг в префронтальной коре головного мозга с помощью метода фотохимического тромбоза. Контроль или Р­А­антитела к белку S100 вводили внутрижелудочно в течение 9 суток после моделирования ишемического инсульта. Нейропротективную активность исследуемых препаратов оценивали, исходя из площади очага поражения до и после введения препаратов. *p<0,05 по сравнению с контролем.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 18. Результаты исследования вовлечённости сигма­1­рецептора (А) и серотониновых (Б) рецепторов в механизм действия Р­А­антител к белку S100.

Исследование влияния Р­А­антител к белку S­100 на связывание стандартных радиолигандов: [³H](+)пентазоцин для сигма­1­рецептора (А), [³H]­ЛСД для 5­HT_2B рецептора, [³H]–месулергин для 5­HT_2C, [³H]­BRL43694 для 5­HT₃ (Б) in vitro проводили с использованием клеток Jurkat (сигма­1­рецептор) или CHO­K1 (рецепторы серотонинергической системы). Для оценки общего связывания гомогенаты мембран клеток вносили в лунку вместе с контролем или исследуемым препаратом; добавляли соответствующие радиолиганды; смесь инкубировали, пропускали через фильтры и промывали охлаждённым буфером. Фильтры высушивали и измеряли радиоактивность на сцинтилляционном счётчике. Неспецифическое связывание измеряли аналогичным образом, но вместо препарата или контроля в лунку добавляли немеченый лиганд (галоперидол (10 мкM) для сигма­1­рецептора; ритансерин (1 мкМ), 5­гидрокситриптамин (100 мкМ) или MDL72222 (100 мкМ) для 5­HT_2B, 5­HT_2С и 5­HT₃ рецепторов соответственно). Показатели специфического связывания радиолиганда с соответствующим рецептором рассчитывали как разность между общим и неспецифическим связыванием. Результаты выражали в процентах от специфического связывания в контроле.

 

 Экспериментальное изучение «малых доз», включая все необходимые токсикологические тесты и фундаментальное изучение молекулярных механизмов действия, явилось первым шагом к созданию на основе антител нового класса лекарственных препаратов, разработчики которого были отмечены премией Правительства РФ за 2005 г.; в 2006 г. премией Правительства РФ за разработку препарата Тенотен была удостоена группа молодых учёных.

Отличительной особенностью препаратов данного класса является то, что вместо той или иной регуляторной молекулы (эритропоэтин, ИФН-γ, инсулин и т.д.) в организм вводится модификатор взаимодействия этой молекулы с её биологической мишенью в виде «высоких разведений» поликлональных антител к этой молекуле или к её рецептору.

Поскольку для препаратов в «малых дозах» не существует биологических барьеров, а значит – и проблемы биодоступности, главным преимуществом Р­А­антител является способность специфически воздействовать на любую молекулу­мишень в организме. Например, препарат, содержащий «малые дозы» антител к  β­субъединице рецептора инсулина, специ­фически воздействует на свою мишень – внутриклеточный домен рецептора инсулина, что приводит к активации сопряжённого с инсулиновым рецептором сигнального пути, вызывая повышение продукции адипонектина (рис. 19).

 

Рис. 19. Специфичность действия Р­А­антител к  β­субъединице рецептора инсулина.

Исследование проводили на зрелых адипоцитах человека. Клетки человека инкубировали в течение 3 суток в присутствии тестируемых образцов. Оценивали способность комбинированного препарата, содержащего Р­А­антитела к  β­субъединице рецептора инсулина (ИР) и Р­А­антитела к эндотелиальной NO­синтазе (eNOS), в отсутствие инсулина влиять на секрецию адипонектина. Уровень секреции адипонектина в питательной среде измеряли с использованием ИФА. *p<0,001 по сравнению с другими группами.

 

 Также важным достоинством препаратов на основе «малых доз» является их нормализующее, адаптивное действие. Например, препарат, содержащий Р­А­антитела к эритропоэтину, нормализует уровень эритропоэтина как в случае его повышения, так и в случае снижения относительно нормы (рис. 20).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 20. Нормализующее действие Р­А­антител к эритропоэтину.

А: Исследование проводили на модели миелосупрессии у мышей линии CBA/CaLac. Патологию вызывали однократным внутрибрюшинным введением 100 мг/кг карбоплатина. За 5 суток до введения карбоплатина и в течение 10 суток после животные получали внутрижелудочно Р­А­антитела к эритропоэтину или контроль. Содержание эритропоэтина в сыворотке крови определяли с помощью ИФА. *p<0,05 по сравнению с мышами, получавшими карбоплатин (100 мг/кг) + контроль.

Б: Исследование проводили на модели иммобилизационного стресса у мышей линии CBA/CaLac. Животные в течение 10 суток после 10­часовой иммобилизации получали внутрижелудочно Р­А­антитела к эритропоэтину или контроль. Содержание эритропоэтина в сыворотке крови определяли с помощью ИФА. *p<0,05 по сравнению с мышами, получавшими эритропоэтин (0,2 мл/животное) + контроль.

 Препараты в «малых дозах» практически не имеют токсичности, мы не наблюдали случаев пристрастия и привыкания к ним.

  Следующим шагом к созданию нового класса лекарственных препаратов явилось проведение рандомизированных клинических исследований (РКИ) в соответствии с принципами доказательной медицины. Возможность таргетного воздействия на ключевые патологические процессы при конкретной нозологии была использована для разработки инновационных средств для лечения гриппа и острых респираторных вирусных инфекций, ожирения и сахарного диабета 1­го и 2­го типа, тревожных расстройств, синдрома раздражённого кишечника, ВИЧ­инфекции и др.

Только за последние несколько лет с разрешения Минздрава России и регуляторов других стран проведено более 30 РКИ с участием около 7 тыс. пациентов, из которых около 3 тыс. – дети, начиная с возраста 1 месяц. Пострегистрационный опыт применения препаратов включает значительно большее число участников независимых (инициативных) исследований.

В РКИ принимали и принимают участие ведущие медицинские и научно­исследовательские центры России, стран СНГ, а также некоторых стран дальнего зарубежья.

В ходе РКИ, проведённых в соответствии с правилами Надлежащей клинической практики, было прежде всего показано, что, в отличие от казуальной гомеопатии, эффективность современных фармакологических препаратов на основе «малых доз» может быть установлена в ходе классических клинических испытаний, и они могут соответствовать канонам доказательной медицины.

В качестве примера клинической эффективности Р­А­препаратов на основе поликлональных антител приводим краткое резюме клинических исследований комплексного трёхкомпонентного препарата Эргоферон для лечения гриппа и острых респираторных вирусных инфекций.

В связи с тем, что в состав препарата входят Р­А­антитела к СD4­рецептору лимфоцитов, он оказывает влияние на клеточное звено иммунитета. За последние несколько лет в клинических исследованиях препарата Эргоферон уже приняли участие 2028 пациентов. К настоящему времени завершён анализ трёх многоцентровых РКИ с участием 1067 пациентов, в том числе 306 детей, в ходе которых методом двойного слепого плацебоконтроля доказана эффективность Эргоферона в лечении острых респираторных вирусных инфекций. В многоцентровом сравнительном РКИ с применением дизайна «Non­inferiority» показана сопоставимость терапевтической эффективности Эргоферона и осельтамивира/Тамифлю^® у взрослых пациентов с сезонным гриппом А и В. Результаты данного РКИ размещены на сайте ClinicalTrials.gov и опубликованы в научном рецензируемом журнале Международного общества по инфекционным заболеваниям – «International Journal of Infectious Diseases».

Таким образом, экспериментально и клинически мы доказали, что фармакологическое действие «малых доз» воспроизводимо и сопоставимо по эффективности с действием «обычных» лекарственных средств тех же фармакотерапевтических групп; при этом они не вызывают серьёзных нежелательных реакций.

Полученные результаты и прежде всего данные по клинической апробации были представлены в ходе научных консультаций в ведущих мировых медицинских агентствах – Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA), Европейское агентство лекарственных средств (EMA, Европа) и Агентство по регулированию лекарственных средств и продуктов для здравоохранения (MHRA, Великобритания). В результате анализа и обсуждения мы везде получили заключение, что препараты на основе Р­А­антител не являются гомеопатическими, а относятся к биологическим препаратам. В качестве примера приводим выдержку из документа Ref: 1029/Anaferon от 28 сентября 2015 г. по результатам научных консультаций с экспертами MHRA (Великобритания): «Анаферон не должен регистрироваться в соответствии с государственными требованиями Великобритании к гомеопатическим препаратам, поскольку в настоящее время препарат находится вне рамок британских гомеопатических традиций по указанным показаниям. Анаферон считается биологическим препаратом и подлежит полной процедуре регистрации лекарственного средства. Поскольку это противовирусный лекарственный препарат, то Централизованная процедура – единственный способ регистрации препарата Анаферон».

В России на сегодняшний день указанные препараты также не относятся к гомеопатическим. Мы проводим большую работу по международной унификации требований к инновационным препаратам, созданным нашей фирмой, и утверждению для них единой терминологии.

Наконец, мы сделали следующий очень важный шаг к созданию нового класса лекарственных средств – разработали принципы детекции релиз­активности.

Много лет назад мы установили, что основное модифицирующее действие «малых доз» воспроизводится вне организма. Например, с помощью «высоких разведений» мы изменяли скорость химических реакций (рис. 21) и физико­химические свойства исходных веществ.