Генная терапия мозга

Над внедрением новой технологии в практику работают сейчас ученые Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН. На одной из научных сессий Общего собрания РАН было заслушано сообщение директора ИВНДиНФ РАН профессора П.Балабана о создании инновационной технологии исследования мозга. С ее помощью можно будет направленно изменять геном определенной области мозга, очень локальной, тем самым меняя работу одного гена буквально в нескольких тысячах клеток. И что важно - делать это не в культуре ткани, а в целом мозгу у взрослых животных, то есть корректировать его работу без использования химических препаратов. Технология, разработанная учеными, представляет собой, по сути, генную терапию мозга, подверженного болезням Паркинсона или Альцгеймера.

Управляя экспрессией генов

- Мы изучаем механизмы организации поведения животных и человека, высшие функции мозга (обучение, память, сознание), а также механизмы развития заболеваний, приводящих к нарушениям нормальной работы нервной системы, - рассказывает Павел Балабан. - Одним из важных современных направлений исследования работы мозга является сегодня применение технологий визуализации.

Суть визуализации электрических и биохимических процессов в одной клетке заключается в том, что она позволяет не только проследить изменения во времени, но и оценить изменения в пространственном объеме мозга, установить роль отдельных частей нервной клетки и их взаимоотношения. Для ученых представляется особенно важным применение новых технологий при изучении процессов обучения и формирования памяти, развития патологий мозга.

- Уже давно было высказано предположение о том, что нервные клетки общаются между собой с помощью химических сигналов, - отмечает профессор П. Балабан. - Но только в последние годы удалось увидеть эти молекулы в действии и понять способы регуляции взаимодействия клеток мозга. В работах сотрудников нашего института зарегистрированы с помощью оптических методов изменения концентрации ионов, потенциалов и токов в тончайших отростках нервных клеток. Визуализация позволяет совершенно иначе взглянуть на химические и электрические процессы и, кроме того, выдвинуть предположения о механизмах хранения памяти, изменений при болезнях мозга и путях наименее травматичной коррекции патологии.

Знание механизмов и принципов нейрохимического управления работы мозга, наряду с появившейся недавно расшифровкой генетической информации, позволяет ученым в настоящее время вплотную подойти к решению задач лечения организма без инородных лекарственных средств. Это стало возможным только за счет вмешательства в работу генетического аппарата отдельных клеток и коррекции в нужную для нормальной работы организма сторону. Генетическую информацию вводят, к примеру, в подкорковые ядра головного мозга, чтобы повышать или понижать уровень медиатора - вещества, передающего нервный импульс от одного нейрона к другому. И таким образом могут произойти хронические изменения в поведении, соответствующие клинической картине при нейродегенеративных заболеваниях.

Управление экспрессией генов в центральной нервной системе - наиболее перспективная технология сегодняшнего дня. С одной стороны, она позволит бороться с большим количеством нейрогенных заболеваний, а с другой - даст возможность, изменяя уровень нейромедиаторов в определенных структурах головного мозга, напрямую подойти к пониманию роли этих структур и медиаторов, их значения для поведения и памяти.

Основной задачей при разработке технологии коррекции работы генетического аппарата ученые считают доставку нового генетического материала в ядро нервной клетки. К настоящему времени наиболее эффективен метод переноса генетического материала с помощью неспособных к размножению вирусов.

- Метод вирусного переноса генов во взрослом организме является одним из самых современных и перспективных средств контроля генетического аппарата, - говорит П.Балабан. - Перенос генов осуществляется в центральную нервную систему, а это предоставляет экспериментатору такие же возможности, которые дает применение фармакологических препаратов, технология создания трансгенных животных... Но, кроме того, наш метод позволяет производить очень точные локальные изменения функционирования клеток нервной системы. В настоящее время такая технология не имеет альтернатив при работе с животными in vivo.

Информацию переносят лентивирусы

Вирусные частицы представляют собой модифицированный самоинактивирующийся лентивирус. Это группа ретровирусов, к которой относится, например, вирус иммунодефицита человека, неспособный к размножению и воспроизводству вирусных элементов. Для получения лентивируса учеными проводятся специальные манипуляции с «клетками-упаковщиками», что делает невозможным размножение вируса в организме и обеспечивает безопасность самого экспериментатора.

Но пока еще, утверждают специалисты, до применения методов генной терапии на человеке очень далеко. В настоящее время благодаря новой технологии предполагается создание моделей нейродегенерации на животных. Это необходимо для исследования молекулярно-генетических механизмов патогенеза с возможностью оптического контроля степени экспрессии перенесенных генов, что позволит специалистам применять патогенетически обоснованную терапию и предупреждать возникновение заболеваний.

По отдельности все компоненты данной технологии хорошо известны и применяются в разных областях научных исследований. Новизна разработанной технологии под названием «Тканеспецифичная лентивирусная трансфекция с возможностью направленных изменений экспрессии генов в локальных областях мозга для исследования механизмов церебральных патологий» состоит в том, что четко определяются технические условия, параметры, проверяются последствия...

Сегодня в Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН разработкой данной технологии на животных занимается лаборатория клеточной нейробиологии, которой руководит кандидат биологических наук С.Саложин. На данный момент отработана методика стереотаксического введения суспензии вирусных частиц в структуры головного мозга крыс. Для этого сдано в эксплуатацию и оборудовано помещение для производства и манипуляций с лентивирусами (и уже проведены первые эксперименты). В комплекс вошли культуральный блок, операционная, помещения для содержания животных. Отработаны протоколы производства вируса и стереотаксического введения лентивирусов в мозг подопытных животных, а также экспериментально показана эффективность локальной трансфекции, полностью налажен оптический контроль эффективности метода в таких конкретных условиях. Ученые смогли получить генетические конструкции для экспрессии (в том числе нейронспецифичной) нейротрофических, нейропротекторных и проапоптотических белковых факторов, которые в дальнейшем будут использованы для сцепления с лентивирусными частицами и получения суспензии для введения в мозг.

Предупреждать и бороться

По результатам применения новой технологии предполагается создание на животных моделей нейродегенерации для исследования молекулярно-генетических механизмов патогенеза с возможностью оптического контроля степени экспрессии перенесенных генов. Экспрессия генетической информации, иначе говоря, преобразование ее в РНК или белок, происходит на высоком уровне, локально и продолжительно. А для того чтобы следить за процессом, в вектор также вводят ген флуоресцентного белка. После попадания внутрь клетки белок начинает синтезироваться. Его свечение, означая активацию новых генов, позволит специалистам точно сказать, в каких клетках изменилась экспрессия. Лентивирусы при этом размножаться в мозгу не могут, по сравнению с ранее применяемыми ретровирусными системами они менее опасны и вряд ли вызовут развитие злокачественной опухоли. Всё это даст возможность ученым применять патогенетически обоснованную терапию и предупреждать возникновение заболеваний.

За рубежом генная терапия отлаживается практически во всех крупных центрах, но специфические проблемы мозга пока решаются всего в нескольких лабораториях.

- При помощи технологии лентивирусной трансфекции появляется возможность хронически менять уровень экспрессии того или иного нейромедиатора в определенной структуре нервной системы, - говорит профессор П.Балабан. - В самом деле, методом РНК-интерференции можно понизить уровень синтеза исследуемого нейромедиатора в нейронах, а методом гиперэкспрессии - увеличить продукцию медиатора. Используя метод лентивирусной трансфекции, можно увеличить или уменьшить продукцию интересующего нас нейромедиатора в конкретных структурах, что, как известно из клинической практики, лежит в основе хронических изменений, приводящих к нейропатологиям. Мы полагаем, что развитие технологии лентивирусной трансфекции позволит в будущем проводить коррекцию уровня нейромедиаторов в нервной системе человека и, таким образом, бороться с множеством нейрогенных заболеваний. С другой стороны, возможность изменять уровень нейромедиаторов в определенных структурах головного мозга у животных в свободном поведении позволит напрямую подойти к пониманию физиологической роли этих структур и медиаторов и, безусловно, поможет непосредственно подойти к решению проблемы памяти и даже сознания.

В исследованиях, связанных с изучением нейропатологий, ученые планируют ограничить экспрессию белков только определенными группами нейронов - тех, которые в первую очередь подвержены дегенерации. Это будет достигнуто с помощью использования специфических промоторов. Всё это опять-таки поможет изучать молекулярные механизмы нейродегенеративных заболеваний и искать подходы для компенсации нарушения функций нервной системы. Благодаря технологии, разработанной в Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, позволяющей проводить генетические манипуляции на уровне отдельных групп нейронов в мозгу животных, можно будет получать более точные и достоверные данные. Кроме того, появится возможность избежать побочных эффектов, возникающих при системном или локальном введении фармакологических препаратов.

Коррекция работы клетки

- Нервная система - самая сложная в организме, - говорит П.Балабан. - Большое разнообразие выполняемых ею функций отражается и в большом количестве морфологически и функционально обособленных структур, каждая из которых сформирована несколькими типами нейрональных и глиальных клеток. Как правило, выполнение отдельной функции или конкретной задачи требует согласованного действия разных типов клеток в разных структурах мозга, образования временной функциональной сети. Изучение роли отдельных типов клеток, сигнальных механизмов, внутриклеточных сигнальных каскадов, белков и регуляторных факторов при нормальном функционировании нервной системы, в эмбриональном и постэмбриональном развитии организма в норме и при патологии требует высокого методологического уровня и мультидисциплинарных подходов. Подобные исследования немыслимы при отсутствии инструментов, позволяющих регулировать и измерять активность определенных сигнальных путей. В качестве основных регуляторов активности рецепторов, промежуточных звеньев сигнальных каскадов, транскрипционных факторов и многого другого в науке широко используются фармакологические агенты. Однако такой подход обладает определенными существенными недостатками: наличием неспецифических эффектов, отсутствием тканеспецифичности, а также необходимостью длительного подбора и синтеза фармакологического агента к каждому белку (включая, возможно, и различные сплайс-варианты этого белка).

Применение фармакологического агента далеко не всегда дает возможность необратимо изменить уровень экспрессии интересующего гена и проследить судьбу модифицированных клеток в развитии организма в целом или в течение длительного периода времени. К тому же ни фармакологические методы, ни даже технологии создания трансгенных животных не позволяют добиться пространственного ограничения и работать с отдельными интересующими экспериментатора структурами. Оптимальным подходом к коррекции работы клетки было бы направленное изменение деятельности генетического аппарата - либо путем встраивания новых генов, либо путем блокады уже работающих генов.

- Лентивирусы потенциально трансдуцируют большинство клеток мозга, экспрессия генетического материала происходит на высоком уровне и достаточно продолжительна, - заключает П.Балабан. - Распространение лентивирусной трансфекции идет в пределах, ограниченных диффузией из зоны инъекции. Таким образом, появляется уникальная возможность путем стереотаксической инъекции лентивирусов в подкорковые ядра или целые области коры головного мозга хронически повышать или понижать в них уровень того или иного белкового фактора, медиатора.

Эффективность и специфичность переноса и экспрессии генетического материала проверяется методами молекулярной биологии и гистохимии. Сочетание данного подхода с традиционными электрофизиологическими, биохимическими экспериментами, а также исследованием поведения помогает получать более подробную и корректную информацию об участии исследуемого белкового фактора в физиологических процессах.

Разработанные к настоящему моменту учеными ИВНДиНФ РАН методологические подходы к изучению нервной системы с использованием лентивирусной трансфекции дают возможность решать большое количество научных и практических задач. Общеизвестно, что нарушение работы одного или нескольких элементов в определенной структуре мозга может иметь негативное последствие для функционирования всей нервной системы. Один из наиболее ярких примеров - нарушение работы дофаминергических нейронов в черной субстанции, что приводит к развитию болезни Паркинсона.

Татьяна КУЗИВ, корр. «МГ».