Вакцины нового поколения

Ученые всего мира возлагают сейчас большие надежды на генетически проектируемые вакцины - новое мощное средство в борьбе со многими заболеваниями, в том числе раковыми. Такие вакцины должны активировать иммунную систему человека настолько, чтобы она стала отторгать раковые клетки.

Каким образом сделать так, чтобы иммунная система начала воспринимать раковые клетки как чужеродные? Из каких фрагментов ДНК создается генетическая вакцина, какими способами она вводится и каковы перспективы использования ДНК-вакцин? Об этом рассказывает заместитель директора по науке НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН профессор Борис НАРОДИЦКИЙ.

- Первая попытка предотвращения заболевания путем вакцинации была предпринята еще в XVII веке. Э.Дженнер привил ребенку коровью оспу, предотвратив последующее заражение настоящей оспой. С момента этого открытия был создан целый ряд вакцинных препаратов против многих опасных и распространенных инфекций. Именно с введением вакцинации в медицинскую практику связывают снижение заболеваемости дифтерией, корью, столбняком, туляремией, полиомиелитом и исчезновение такой опасной инфекции, как оспа.

Эффективность подавляющего большинства вакцинных препаратов зависит от индукции протективного гуморального иммунитета, который, в свою очередь, определяется стабильной структурой поверхностных антигенов микроорганизма, против которого происходит вакцинация, а также остротой протекания болезни. Для латентных или хронических заболеваний, вызываемых такими возбудителями, как ВИЧ, вирус герпеса человека типа I, вирус гепатита С, микобактерии туберкулеза, а также для болезней, вызываемых микроорганизмами, характеризующимися внутривидовой изменчивостью (серологические варианты, антигенный дрейф или сдвиг), эффективных вакцин не создано. Очевидно, что для получения вакцин против подобных инфекций необходимы детальное понимание биологии и патогенеза каждого конкретного возбудителя и разработка индивидуальных подходов к созданию вакцинных препаратов.

Современные успехи в молекулярной биологии, иммунологии и молекулярной биотехнологии стимулировали появление новых направлений в получении вакцин, которые основываются на методах генной инженерии. Вакцины, созданные с применением этих методов, подразделяются на два класса: субъединичные (протективные антигены различных возбудителей, экспрессированные в дрожжах) и генетические вакцины. В свою очередь, генетические вакцины делятся на ДНК-вакцины и вакцины, базирующиеся на вирусных и бактериальных векторах.

Мы будем говорить о генетических вакцинах. В отличие от большинства традиционных генетические вакцины способны индуцировать и клеточный, и гуморальный иммунный ответ. Дополнительным преимуществом таких вакцин является возможность их использования не только в превентивных, но и в терапевтических целях для лечения аутоиммунных заболеваний, аллергий, злокачественных новообразований.

ДНК-вакцины

Первой работой, положившей начало развитию генетической вакцинации, была работа Wolff с соавт., в которой они показали возможность эффективной экспрессии генетического материала в клетках in vivo после внутримышечной инъекции плазмидной ДНК.

В 1992 г. Tang с соавт. в серии экспериментов по изменению роста мышей путем бомбардировки клеток золотыми частицами, покрытыми плазмидной ДНК, экспрессирующей человеческий гормон роста, наблюдали образование специфических сывороточных антител, которые замедляли рост. В 1993 г., после первого сообщения о развитии гуморального иммунного ответа на введение плазмидной ДНК, Ulmer с соавт. показали образование специфических цитотоксических лимфоцитов в ответ на внутримышечное введение плазмиды, кодирующей нуклеопротеин вируса гриппа. Успех данного эксперимента заключался не только в индуцировании цитотоксического ответа, но и в обеспечении защиты 90% животных от летальной дозы заражения. В этом же году двумя независимыми группами ученых была охарактеризована способность ДНК-вакцин индуцировать иммунный ответ при различных способах иммунизации. В 1995 г. ДНК-вакцины были впервые успешно апробированы в качестве генетического адъюванта.

За более чем 10-летнюю историю существования «генетической иммунизации» для ДНК-вакцин были выявлены как очевидные преимущества, так и недостатки. Главными преимуществами ДНК-вакцин являются их способность индуцировать клеточный и гуморальный иммунный ответ, а также возможность их использования для создания вакцин против особо опасных и плохо культивируемых патогенов. Среди недостатков ДНК-вакцин следует отметить возможный атипичный процессинг бактериальных антигенов в клетках млекопитающих и низкий (по сравнению с традиционными вакцинами) уровень гуморального иммунного ответа. Возможность инсерционного мутагенеза не может восприниматься в качестве существенного недостатка, так как это чрезвычайно редкое событие, происходящее с частотой 1 на 150 тыс. ядер. Это более чем в тысячу раз меньше частоты возникновения спонтанных мутаций.

ДНК-вакцины представляют собой плазмидный вектор, в состав которого входит ген, кодирующий определенный антиген, и несколько элементов, обеспечивающих транскрипционный контроль этого гена (промотор и сигнал полиаденилирования). Кроме этого, в составе плазмидной ДНК может находиться последовательность нуклеотидов, способствующая активации врожденного иммунного ответа.

Способы введения

Введение ДНК-вакцин производится парентерально или через слизистые. Парентеральное введение осуществляется двумя способами: посредством метода gene-gun (так называемой «генной пушки») и инъекционно. Способы доставки ДНК-вакцин имеют существенные различия не только по количеству используемой в методе ДНК (для инъекционного способа введения ДНК-вакцин требуются в 100-1000 раз большие количества ДНК по сравнению с методом gene-gun), но и по типу индуцируемого иммунного ответа.

Среди инъекционных способов введения (внутрикожный, внутримышечный, внутривенный, подкожный и др.) наибольшую эффективность показали внутримышечный и внутрикожный способы доставки.

Вакцинация с помощью gene-gun была одинаково эффективна при внутрикожном и внутримышечном (после предварительного оперативного вмешательства) способах введения. В целом же метод gene-gun обладает наибольшей эффективностью трансфекции клеток и локальностью по сравнению с инъекционным способом введения ДНК.

Иммунизация через слизистые (интратрахеальная, ректальная и вагинальная) является менее охарактеризованным способом введения ДНК-вакцин. Различными группами ученых были получены противоречивые данные по эффективности этого подхода. Лучшие результаты в индукции иммунного ответа после иммунизации через слизистые отмечались при использовании ДНК-липосомных комплексов.

Механизм развития иммунных реакций в ответ на генетическую иммунизацию полностью не охарактеризован, но основные закономерности его развития понятны. По всей вероятности, тип иммунного ответа зависит от способа, места иммунизации и природы экспрессируемого антигена.

Применение ДНК-вакцин

Эффективность ДНК-вакцин тестировалась в различных предклинических испытаниях. Но особое внимание хотелось бы уделить их клиническим испытаниям. Связано это с тем, что многие ДНК-вакцины, оказавшиеся эффективными в экспериментах на животных, не оказывали существенного влияния на активацию иммунной системы или изменение характера течения болезни у людей.

Первая стадия клинических испытаний ДНК-вакцины против вируса иммунодефицита человека, экспрессирующей белки env/rev, подтвердила безопасность и иммуногенность данной вакцины у ВИЧ-позитивных и ВИЧ-негативных индивидуумов. Неинфицированные добровольцы, получавшие большие дозы ДНК-вакцины, показывали развитие антигенспецифического лимфопролиферативного иммунного ответа вкупе с экспрессией цитокинов. Однако, оценивая в целом результаты данной части эксперимента, можно отметить, что иммунный ответ был слабым и не персистентным.

У ВИЧ-позитивных пациентов наблюдали образование специфических антител, но не наблюдали существенной активации цитотоксического иммунного ответа. Параллельные клинические испытания, в которых тестировалась эффективность ДНК-вакцины, экспрессирующей гены rev, nef и tat, дали результаты несколько иного рода. Иммунизация ВИЧ-позитивных больных усиливала клеточный иммунный ответ, но практически не влияла на изменение соотношения лимфоцитов и прогрессию заболевания. Еще в одних клинических испытаниях тестируется эффективность ДНК-вакцины, экспрессирующей гены ВИЧ в сравнении с репликативно-дефектным аденовирусом, экспрессирующим те же гены.

Клинические испытания ДНК-вакцин против гепатита В, в которых были задействованы только НВV-негативные добровольцы, также подтвердили безопасность ДНК-вакцины. Все вакцинированные добровольцы показали развитие протективного гуморального иммунного ответа.

В настоящее время проводится первая и вторая фаза клинических испытаний по иммунотерапии различных лимфом и опухолей толстой кишки. Эти испытания должны дать оценку целесообразности использования ДНК-вакцин в терапии злокачественных образований.

Перспективы использования ДНК-вакцин

Целый ряд ДНК-вакцин находится в клинических испытаниях, поэтому окончательные суждения об их эффективности делать рано. Однако уже сегодня очевидны возможности модификации ДНК-вакцин, направленные в конечном итоге на увеличение их иммуногенности. Одно из таких направлений ориентировано на изменение кодонов в генах белков различных микроорганизмов, не приводящее к изменению аминокислотного состава.

Оригинальный подход был предложен испанскими учеными, которые добились повышения экспрессии антигена и увеличения иммуногенности ДНК-вакцины за счет линеаризации плазмидного вектора, экспрессирующего антиген, и последующей модификации концов ДНК, к которым «пришивали» пептид, содержащий сигнал ядерной локализации.

К другому активно исследуемому направлению относится совместное введение ДНК-вакцин, экспрессирующих определенный антиген и плазмид, ответственных за синтез различных цитокинов, хемокинов или других иммуностимуляторных молекул.

Увеличения иммуногенности ДНК-вакцин также добиваются за счет повышения эффективности трансфекции клеток. Одним из перспективных методов является электропорация in vivo. Применение электропорации после инъекции ДНК-вакцины существенно увеличивает процент трансфицированных клеток, что, в свою очередь, ведет к повышению уровня экспрессии антигенов и увеличению иммуногенности. Для увеличения эффективности доставки также используются комплексы ДНК-вакцин с липосомами или другими субстанциями. Хорошие результаты были получены при использовании ДНК-вакцины, адсорбированной на катионные микрочастицы. Такая обработка замедляла деградацию ДНК и увеличивала эффективность ее доставки. Дополнительная обработка таких частиц фосфатом алюминия увеличивала титр сывороточных антител по меньшей мере в 250 раз по сравнению с нативной ДНК-вакциной. Необходимо отметить, что максимальный уровень гуморального иммунного ответа наблюдался для частиц размером 300 нм и уменьшался при увеличении диаметра частиц. Авторы объясняют данный факт предпочтительным проникновением в антигенпрезентирующие клетки частиц меньшего размера.

История генетической иммунизации насчитывает всего 12 лет. Значительную часть этого времени исследователи потратили на понимание возможностей данного подхода, а также на изучение механизмов развития иммунных реакций в ответ на генетическую иммунизацию и определение мишеней и средств (генов, заболеваний, векторных систем).

Понимание механизмов дало возможность направленного моделирования структуры генетической вакцины и выбора стратегии иммунизации в соответствии с тем типом иммунного ответа, который необходимо индуцировать. Яркими положительными примерами являются результаты первой стадии клинических испытаний генетических вакцин против таких заболеваний, как малярия и гепатит В. Очевидно, что при грамотном использовании уже полученных данных мы вправе ожидать положительных результатов от применения генетических вакцин и в других исследованиях.

Следует, однако, отметить и негативные моменты в развитии генетической иммунизации. ДНК-вакцины, как и любые вакцины, не смогут стать панацеей, поэтому каждый раз при выборе объекта (возбудителя) необходимо учитывать особенности его взаимодействия с организмом. Именно ошибками при выборе и в конечном счете переоценкой возможностей подхода объясняются многие негативные результаты. Например, неудачные попытки генетической иммунизации ВИЧ-негативных и ВИЧ-позитивных индивидуумов связаны в первую очередь с не персистентным иммунным ответом, который возникает после вакцинации, а также с характером протекания болезни и особенностями возбудителя.

Помимо всего прочего, причиной неудач в будущем может становиться развитие не отвечаемости к антигену. Известно, что в некоторых случаях повторяющиеся инъекции небольших количеств антигена могут быть причиной развития толерантности. Так как ДНК-вакцины обеспечивают экспрессию небольших количеств антигена на протяжении нескольких недель, это также может стать причиной развития подобного рода не отвечаемости. Правда, за всю историю существования генетической иммунизации такой случай был зафиксирован лишь однажды.

Перспективы использования ДНК-вакцин в первую очередь связаны с возможностью их применения для переключения типа иммунного ответа (Тх1-Тх2), что может быть использовано для терапии аллергических и аутоиммунных состояний. Для противоинфекционных заболеваний, несомненно, наиболее важным и перспективным представляется направление, сочетающее совместное использование ДНК-вакцин с другими генетическими вакцинами и/или с традиционными вакцинами.

Записала
Татьяна КУЗИВ,
корр. «МГ».