Бактерии приспосабливаются к антибиотикам

Ученые Института молекулярной генетики РАН изучают свойства устойчивых к антибиотикам микроорганизмов и закономерности их распространения в природе. Об этом нам рассказала ведущий научный сотрудник института доктор биологических наук Софья МИНДЛИН.

- К настоящему времени накоплены многочисленные факты, говорящие о том, что интенсивное использование антибиотиков неизбежно приводит к возникновению устойчивых к ним штаммов бактерий. Процесс их возникновения и распространения происходит с огромной скоростью, буквально на глазах исследователей. Для примера: в коллекции Муррея, содержащей 433 штамма кишечной палочки, которые были собраны в 1885-1941 гг., штаммы, устойчивые к антибиотикам, составляли менее 3%. В коллекциях, собранных позднее, содержание таких устойчивых штаммов составляло уже десятки процентов. Из 72 штаммов E.coli из ECOR - коллекции, собранной в период 1973-1983 гг., 18 (25%) были устойчивы по крайней мере к одному антибиотику, и 14 (около 20%) - к двум или более. За какие-нибудь 10-15 лет при продолжающемся интенсивном применении антибиотиков штаммы бактерий, устойчивые одновременно к нескольким различным антибиотикам, практически полностью вытеснили штаммы, устойчивые только к одному из них.

Распространение множественной лекарственной устойчивости исследователи наблюдали не только в клинике, но и в сельском хозяйстве, а также среди штаммов бактерий, обитающих в природных источниках. Понимая актуальность проблемы, многие лаборатории мира начиная с конца 70-х годов прошлого столетия, активно включились в работу по изучению моле-кулярно-генетической природы устойчивости к антибиотикам, распространенности в бактериях различных систематических групп. Изучались также механизмы перемещения от одних видов бактерий к другим (так называемый горизонтальный перенос) с помощью различных мобильных элементов (плазмид, транспозонов и интегронов).

Устойчивость бактерий к антибиотикам основана на действии различных биохимических механизмов. Большинство из них ученым удалось расшифровать, как, например, реакции энзиматической инактивации молекул антибиотика. Эти механизмы действуют в отношении антибиотиков, которые относятся к самым различным классам химических соединений, таких как бета-лактамы (пенициллины и цефалоспорины), аминогликозиды (стрептомицин, канамицин, гента-мицин), эритромицин, линкомицин и родственные им соединения. Еще один распространенный тип устойчивости связан с изменением структуры молекулы-мишени, с которой связывается антибиотик. В данном случае в результате модификации мишени процесс связывания с ней либо частично, либо полностью нарушается. Подобные механизмы имеют место в отношении антибиотиков, нарушающих функционирование рибосом. К примеру, метилирование рибосомной РНК эффективно защищает бактериальную клетку от летального действия эритромицина. Известна устойчивость микроорганизмов к антибиотикам и другим веществам из-за нарушения проницаемости наружной мембраны бактерий и других механизмов, то есть способы защиты очень разнообразны.

Устойчивость бактерий даже к одному антибиотику зависит от действия многих генов. И, следовательно, огромное количество генов задействовано в определении устойчивости к антибиотикам, использующимся в различных областях медицины, ветеринарии и сельского хозяйства. Общее число генов, кодирующих устойчивость к антибиотикам, пока еще неизвестно. Вероятно, оно исчисляется несколькими сотнями. Например, одних только генов устойчивости к тетрациклинам было охарактеризовано более 30, а генов, определяющих устойчивость к макролидным антибиотикам (эритромицину, олеандомицину, линкомицину, стрептограмину), - более 40. Трудности в определении числа генов устойчивости возникают в первую очередь из-за того, что практически идентичным генам часто присваивают разные обозначения, в особенности тогда, когда разные группы исследователей, причем независимо друг от друга, выделяют их из разных бактерий. Но эта ситуация в последние годы постепенно исправляется благодаря интенсивной работе специалистов по систематизации генов устойчивости различных групп и разработке новой номенклатуры.

Ученым удалось установить, что детерминанты устойчивости бактерий к антибиотикам, распространившиеся в клинике, происходят по крайней мере из двух источников. Первый из них - это штаммы-продуценты антибиотиков, в основном актиномицеты, содержащие гены устойчивости к собственному антибиотику. Второй - собственные гены микроорганизмов, обеспечивающие нормальный метаболизм бактериальной клетки.

Гипотеза о происхождении генов устойчивости к антибиотикам клинических штаммов бактерий от актиномицетов-продуцентов антибиотиков была сформулирована более 30 лет назад. По этой гипотезе, гены устойчивости впервые возникли как необходимый механизм защиты от собственных продуктов метаболизма, а затем попали в геном других бактерий, занимающих различные экологические ниши. Действительно, в геноме многих стрептомицетов-продуцентов были обнаружены гены устойчивости к собственным антибиотикам. Результаты проводимых исследований показали, что гены, гомологичные генам актиномицетов, обнаружены в клинических штаммах бактерий различных систематических групп. Доказательства происхождения генов устойчивости патогенных бактерий от соответствующих генов продуцентов антибиотиков были получены, например, в исследованиях структуры детерминант устойчивости к тетрациклину. Интересно отметить, что тетрациклины начали использовать для лечения кожных инфекций, вызываемых быстрорастущими микобактериями, лишь в конце 70-х годов. Проводимые экспериментальные работы позволяют ученым сделать вывод о том, что по крайней мере часть генов устойчивости, распространившихся в последнее время у клинических штаммов бактерий, произошла от детерминант устойчивости продуцентов антибиотиков (или имеет с ними общее происхождение). Причем можно говорить об очень древнем происхождении этих детерминант. По-видимому, они попали в клетки бактерий, обитающих в организме человека и животных путем горизонтального переноса с помощью таких мобильных элементов микроорганизмов, как плазмиды и транспозоны.
 
Широкое распространение детерминант устойчивости к антибиотикам у клинических штаммов бактерий соотносят, как правило, с присутствием и свойствами различных мобильных элементов. Первоначально в качестве таковых рассматривали именно плазмиды и транспозоны, найденные в бактериях различных систематических групп. Позднее были открыты конъюгативные транспозоны и подробно исследована их роль в переносе генов между грамположительными и грамотрицательными бактериями. Но все-таки основные механизмы, определяющие возникновение и распространение множественно устойчивых штаммов бактерий, и масштабы этого явления стали понятными лишь в последние годы благодаря открытию таких элементов микроорганизмов, как интегроны, и изучению их структуры.

Интегроны - природные системы горизонтального переноса генов, обладающие способностью к захвату фрагментов чужеродной ДНК, и, как теперь стало ясно, играющие ключевую роль в распространении генов устойчивости к лекарственным препаратам, а также в эволюции бактериальных геномов. Исследование интегронов в настоящее время переживает настоящий бум. Об этом можно судить по лавинообразному увеличению числа публикаций, посвященных изучению разнообразия интегронов и генных кассет, их функционированию и путям распространения среди клинических штаммов бактерий. Важнейшим свойством интегронов является их способность интегрировать и экспрессировать новые гены. Интегроны состоят из двух частей: интегронной платформы и так называемых кассет или кассетных генов. Более 70 различных кассет содержат гены, определяющие устойчивость к большинству классов антибиотиков, используемых в медицине: бета-лактамам, аминогликозидам, хлорамфениколу, триметоприму, эритромицину и рифампицину.

Происхождение генов устойчивости, входящих в состав интегронов, несмотря на многочисленные исследования их структуры и механизмов интеграции, в значительной мере остается загадочным. В отличие от обычных, гены, входящие в состав этих мобильных элементов, лишены собственных промоторов. Поэтому для ученых очень важно знать, имеют ли кассетные гены устойчивости к антибиотикам свои аналоги среди автономно функционирующих генов. Анализ литературных данных свидетельствует о том, что родственные гены могут существовать в двух ипостасях: в виде активных генов и в виде генов кассетных, и следовательно, они должны иметь общее происхождение. В нескольких случаях ученым удалось идентифицировать в составе интегронов кассетные гены, определяющие устойчивость к таким новым антибиотикам, как имипенем, амикацин и нетилмицин.

Анализируя литературные данные, ученые Института молекулярной генетики РАН обнаружили несомненную временную связь между введением в лечебную практику новых антибиотиков и возникновением и повсеместным распространением устойчивых к ним клинических штаммов бактерий. При этом было замечено: чем больше проходило времени, тем чаще выделяли штаммы, отмеченные множественной лекарственной устойчивостью, а штаммы, устойчивые к одному или нескольким антибиотикам, встречались всё реже. Параллельно происходили и процессы возникновения и распространения штаммов, несущих детерминанты устойчивости в составе интегронов, а также процессы формирования этих мобильных элементов, содержащих разнообразные наборы кассет.

В ряде случаев удалось продемонстрировать зависимость между встречаемостью в составе интегронов генных кассет, определяющих устойчивость к различным антибиотикам, и временем внедрения этих антибиотиков в медицинскую практику. Например, в составе интегронов, обнаруженных при исследовании 59 устойчивых штаммов Enterobacteriaceae, генные кассеты устойчивости к стрептомицину встречались с частотой 81,4%; кассеты устойчивости к хлорамфени-колу - с частотой 30,5%; к канамицину - с частотой 22%. Частота кассет, контролирующих устойчивость к гентамицину, составляла 16,9%. В той же последовательности (1944, 1947, 1957 и 1963 гг.) были открыты названные антибиотики.

В 60-70-е годы прошлого века накопилось множество фактов, свидетельствующих о роли плазмид преимущественно крупных, в процессе быстрого распространения в клинике устойчивых штаммов бактерий. И тогда закономерно встал вопрос о происхождении этих плазмид: либо они изначально присутствовали в клетках патогенных бактерий (до применения антибиотиков), а затем просто произошло увеличение их численности, либо они сформировались в условиях интенсивного использования различных антибиотиков. Для ответа на этот вопрос специалистам пришлось повторно исследовать штаммы энтеробактерий из коллекции Муррея, выделенные в годы, предшествующие открытию и применению антибиотиков. Был сделан однозначный вывод о том, что начало процесса возникновения и распространения плазмид с генами лекарственной устойчивости следует приурочить к первым годам использования антибиотиков в медицинской практике.

Исследования, выполненные в лабораториях разных стран, показали, что формирование плазмид, несущих гены множественной лекарственной устойчивости, происходило путем внедрения в их ДНК всевозможных мобильных элементов, преимущественно транспозонов и интегронов, и специалистам удалось проследить этапы данного процесса во времени. К примеру, при ретроспективном анализе структуры конъюгативных плазмид Salmonella enterica Typhimurium было установлено, что формирование и повсеместное распространение штаммов сальмонелл, имеющих множественную лекарственную устойчивость, произошло в результате нескольких последовательных актов встраивания интегронов, несущих различные наборы генов устойчивости, в геном этих плазмид.

В дальнейшем ученые неоднократно наблюдали, как по мере внедрения в медицинскую практику новых антибиотиков неизменно появлялись плазмиды, содержащие интегроны с генами, обеспечивающими устойчивость бактерий к этим антибиотикам. В плазмидах «современных» штаммов бактерий специалисты обычно обнаруживают элементы, содержащие длинные цепочки генов устойчивости, иногда до 9 генов. В настоящее время благодаря использованию новых молекулярных методов ученым удалось полностью расшифровать молекулярно-генетическую структуру многих сложных плазмид, обнаруженных в устойчивых штаммах бактерий.

Анализ данных, полученных в результате многолетних исследований, позволяет сформулировать положение о существовании по крайней мере двух путей происхождения генов устойчивости: от генов продуцентов антибиотиков, в основном актиномицетов, и от собственных генов бактерий, включая клинические штаммы. Первые, несомненно, имеют очень древнее происхождение. По-видимому, первоначально они были локализованы в хромосомах актиномицетов-продуцентов и только впоследствии могли оказаться в составе мобильных элементов, таких как плазмиды и транспозоны.

Скорее всего, первыми из микроорганизмов, которые приобрели чужеродные для них гены устойчивости еще в глубокую старину, были почвенные или водные бактерии, обитающие рядом с актиномицетами-продуцентами антибиотиков, в том же микробиоценозе. Бактерии, обитающие в организме человека и животных, приобрели детерминанты устойчивости, вероятнее всего, от бактерий окружающей среды, а за последние 50-60 лет в связи с интенсивным использованием антибиотиков их содержание в популяциях многократно увеличилось.

Об очень давнем происхождении детерминант устойчивости говорят такие факты, как высокий уровень дивергенции между генами продуцентов и генами, распространенными в клинических штаммах бактерий, а также результаты исследований обширных семейств родственных генов.

В отличие от детерминант устойчивости, происходящих от актиномицетов, детерминанты, происходящие от собственных генов бактерий (некоторые из них), возникли и продолжают возникать в ответ на использование антибиотиков, то есть в самое последнее время. Ученые пришли к выводу, что перенос генов между грамположительными и грамотрицательными бактериями происходит постоянно и с очень высокой частотой в естественной среде обитания бактерий, а не только в лабораторных условиях, как предполагалось еще сравнительно недавно.

Уже очевидно, что ведущая роль в формировании блоков генов множественной лекарственной устойчивости принадлежит интегронам. Но, безусловно, ряд важнейших вопросов происхождения и эволюции детерминант устойчивости, в основном касающихся происхождения интегронов и генных кассет, остаются до сих пор недостаточно исследованными. В частности, отсутствуют сведения о существовании интегронов с генами устойчивости в доантибиотическую эру. Пока неизвестно, могли гены акти-номицетов непосредственно включаться в состав мобильных элементов бактерий или нет?

Можно лишь надеяться на то, что многие вопросы будут решены в недалеком будущем, поскольку исследования в этой области интенсивно идут во многих лабораториях мира.

Подготовила
Татьяна КУЗИВ,
корр. «МГ».